以特異性引物延伸為基礎的非綜合征唇腭裂易感基因芯片技術

胥　威　　盧永平　　韓維田▲　　宋方田.遼寧省計劃生育科學研究院　遼寧省生殖健康重點實驗室，遼寧沈陽　003；.遼河油田總醫院婦嬰醫院，遼寧盤錦　400

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以特異性引物延伸為基礎的非綜合征唇腭裂易感基因芯片技術

胥威1盧永平1韓維田1▲宋方田2
1.遼寧省計劃生育科學研究院遼寧省生殖健康重點實驗室，遼寧沈陽110031；2.遼河油田總醫院婦嬰醫院，遼寧盤錦124010

[摘要]目的設計一種適合檢測非綜合征唇腭裂（NSCL/P）相關大量單核苷酸多態性（SNP）的基因芯片。方法直接測序法驗證基因芯片的準確性，重復檢測部分樣品驗證基因芯片的重復性。結果本研究設計了一種以特異性引物延伸為基礎的，適合檢測NSCL/P大量相關SNP的，快速、有效、方便、經濟、高通量的基因芯片。結論這種基因芯片為臨床NSCL/P基因診斷提供一種新型的、靈敏度高、操作簡單的技術手段。

[關鍵詞]基因芯片；特異性引物延伸；非綜合征唇腭裂；單核苷酸多態性

NSCL/P相關SNP的檢測方法很多，包括限制性內切酶酶切法、質譜、直接測序、SNPshot等[1]。這些方法僅適合檢測少量SNP，成百上千的SNP檢測就比較困難。而NSCL/P的發病與大量SNP密切相關。本研究設計了一種適合檢測NSCL/P相關SNP的且快速、方便、有效、經濟、高通量的基因芯片。

1　材料與方法

1.1材料來源

選擇2010年7月～2012年7月間經中國醫科大學附屬口腔醫院醫師確診的NSCL/P患者50例（男27例，女23例，年齡1～35歲，平均9.96歲），均簽署了知情同意書。

1.2儀器及試劑

點樣儀（Nano-Plotter 2.1，GeSiM），GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀（Axon Instruments）；芯片探針和特異性延伸引物及陽性對照（南京生物科技有限公司）見表1。多重PCR試劑盒（Takara），血液基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN），EXOI及堿性磷酸酶（Takara），VentR（exo-）DNA聚合酶（NEB）。

1.3方法

1.3.1芯片制備24條探針選于www.genome.wi.mit.edu.。30 μM探針溶解在0.3 M碳酸鹽緩沖液。60％相對濕度，點樣儀點樣在醛基修飾玻片上。

1.3.2特異性延伸引物的設計特異性延伸引物由3’端位于SNP及其上游序列和5’端位于探針互補序列兩部分構成。每個SNP設計兩條特異性延伸引物與之相匹配。

1.3.3DNA提取20 μL蛋白酶K消化200 μL抗凝血，加入200 μL緩沖液GB，70℃10 min；再加入200 μL無水乙醇充分混勻；吸附柱收集絮狀沉淀；再加500 μL緩沖液GD離心，倒掉廢液；600 μL漂洗液PW漂洗；最后50 μL洗脫緩沖液洗脫DNA。

1.3.4多重PCR擴增及純化體系20 μL（10 μL mix2，0.2 μL mix1，0.2μM引物，50 ng DNA）。反應條件94℃10 min；94℃30 s，57℃90 s，72℃90 s，35個循環；最后72℃10 min。多重PCR產物中加入10 μL mix（1.2 U EXOI，0.4 U堿性磷酸酶）純化，條件：37℃30 min，95℃10 min。

1.3.5特異性引物延伸體系15 μL[純化后產物5 μL，dATP、dTTP、dGTP和Cy3dCTP各0.375 μL，VentR（exo-）DNA聚合酶0.02U，特異性引物0.025 μM]。反應條件94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，35個循環；最后72℃3 min。

1.3.6雜交10 μL延伸產物加入10 μL雜交液MIX （1.33×SSC，0.067％SSC，0.033 mg/mL鮭魚精和50 nMCy3標記陽性對照）同芯片雜交，60℃雜交2 h。

1.3.7芯片掃描及檢測分析共聚焦激光掃描儀掃描芯片。基因型通過計算每個SNP的等位基因分數（AF）讀取，AF=等位基因B/（等位基因A+等位基因B）。AF＜0.4，0.4≤AF≤0.6及AF＞0.6基因型分別為AA，AB及BB。

1.3.8直接測序隨機挑選10％樣本測序，驗證芯片檢測結果。

表1　SNP位點的探針及特異性延伸引物

2　結果

2.1芯片設計

查閱NSCL/P易感基因相關的文章，挑選研究較多的SNP，進行Meta分析（具體檢索中國生物醫學文獻數據庫、中國學術期刊全文數據庫和PUBMED獲得全部相關的中英文文獻，匯總全部文獻中的結果進行分析）。選取與NSCL/P密切相關的SNP（表1），其相應探針陣列見封三圖5A。

2.2芯片檢測結果

封三圖5B可見SNP檢測結果：rs11466285TC， rs2235371CT和rs3917201GA，其他SNP均為常見基因型。

2.3準確性與重復性

芯片檢測50例樣本，檢出率為100％。另外，芯片的檢測結果與直接測序的結果完全一致，準確性（兩種方法檢測結果一致的樣本數/10％樣本總數）亦為100％。隨機選取25個樣本，芯片檢測3次，其結果均一致，重復率（3次芯片檢測結果一致樣本數/25例）為100％。

3　討論

NSCL/P是不伴發其他系統畸形的、不屬任何綜合征的唇裂、唇裂合并腭裂的總稱，是一種常見的先天性顏面部缺陷[2-5]。世界各地發病率為1/2500～1/500，不同種族和地域發病率有很大差異，其中亞洲黃種人最高，歐洲白種人次之，非洲黑種人最低[6，8]。病因研究認為NSCL/P是環境因素和遺傳因素相互作用的結果。遺傳學認為NSCL/P是一種多基因相關的遺傳病。目前，大量NSCL/P發病密切相關候選基因（包括MTHFR、TGFA、TGFB3、RARA、MSX1、IRF6及RFC1等）及其SNP已被確定[9-12]。本研究查閱以往大量文獻，收集相關數據，通過Meta分析，挑選出有意義的且與NSCL/P發病相關的SNP作為檢查對象，來設計基因芯片陣列。

基因芯片是人類基因組計劃帶來的最有應用價值的科研成果，融合了生命科學、化學、微電子技術、計算機科學、統計學和生命信息學等多種學科的最新技術。寡核苷酸芯片技術是目前SNP檢測中最有前景的一種方法，在芯片幾平方毫米的面積上可以固定幾百個檢測探針，具有高通量的特點，同時它的點樣、標記、檢測等的自動化過程高，為準確、高效、低廉的SNP檢測奠定了基礎[13-15]。本研究采用的這種寡核苷酸芯片針對NSCL/P相關7個易感基因的12個SNP位點進行檢測，該方法信息量大、效率高、速度快。本研究采用的以特異性引物延伸為基礎的基因芯片，只需要一種單色熒光系統，而且熒光信號較強，費用較低，同時簡化了數據分析。

本研究中，基因芯片檢測50例NSCL/P樣本，檢出率為100％。隨機選取樣本的測序結果與基因芯片結果完全一致，說明該芯片檢測結果準確可靠。因此，該芯片是一種適合NSCL/P相關SNP檢測的且快速、有效、經濟、高通量的方法，為臨床NSCL/P易感基因檢測提供了一個新的技術平臺。未來我們將在該基因芯片的基礎上添加更多的NSCL/P相關SNP，以滿足將來臨床基因診斷需要。

[參考文獻]

[1] Vieira AR. Association between the transforming growth factor alpha gene and nonsyndromic oral clefts：A HuGE review[J]. Am J Epidemiol，2006，163：790-810.

[2]丁孝東.七氟烷與瑞芬太尼用于嬰幼兒唇腭裂手術麻醉的臨床觀察[J].中國現代醫生，2012，50（20）：83-84.

[3]張興華，郭建.先天性唇腭裂5821例流行病學分析[J].中國現代醫生，2009，47（6）：11-12.

[4]吳海燕，王瑩，王偉偉.三維超聲在胎兒唇腭裂診斷中的應用[J].中國現代醫生，2009，47（36）：99.

[5]郭建忠.七氟烷與丙泊酚用于小兒唇腭裂手術誘導比較[J].中國現代醫生，2008，46（2）：90-91.

[6]沈亞，程璐，萬偉東，等.非綜合征性唇腭裂與干擾素調節因子6和轉化生長因子α單核苷酸多態性的相關性[J].中華檢驗醫學雜志，2007，30（12）：1349-1353.

[7]吳瑛，錢昆英.普通B超社區產前檢查在診斷胎兒唇腭裂中的應用[J].中國現代醫生，2009，47（5）：96.

[8]鄭寶群，許映斌，王楚彬.實時三維超聲診斷胎兒唇腭裂的探討[J].中國現代醫生，2007，45（2）：25.

[9] Wei Xu，Weitian Han，Yongping Lu，et al. Microarray analysis of two single-nucleotide polymorphisms of transforming growth factor alpha in patients with nonsyndromic cleft of north china[J]. CPCJ，2014，51（4）：486-492.

[10] Lu YP，Liu Q，Xu W，et al. TGFA and IRF6 contribute to the risk of nonsydromic cleft lip with or without cleft palate in Northeast China[J]. PLOS ONE，2013，8（8）：e70754.

[11]胥威，韓維田. IRF6基因多態性與非綜合征性唇腭裂的相關性研究進展[J].中國實用醫藥，2015，10（8）：282-283.

[12]盧永平，李增建，劉強，等.應用高分辨率溶解曲線技術檢測唇腭裂TGFA基因Taq 1突變[J].中國醫科大學學報，2010，39（4）：281-285.

[13]吳清華，馬文麗，張寶，等.寡核苷酸陣列引物延伸技術在P53基因突變檢測中的應用[J].癌癥，2005，24（7）：898-902.

[14]沈麗霞，牛建昭.王繼峰應用基因芯片技術檢測金雀異黃素對乳腺癌T47D細胞雌激素受體相關信號通路基因表達的影響[J].北京中醫藥大學學報，2013，36（2）：100-103.

[15]戈海澤，梁慧敏，盧晉英，等.基因芯片技術在常見腸道致病菌感染檢測中的應用[J].山東醫藥，2013，53（4）：24-26，29.

Gene microarray based on allele-specific primer extension for NSCL/P

XU Wei1LU Yongping1HAN Weitian1SONG Fangtian2
1.Liaoning Provincial Research Institute of Family Planning, Liaoning Provincial Key Laboratory of Reproductive Health, Shenyang 110031, China; 2.Liaohe Oilfield General Hospital, Panjin 124010, China

[Abstract]Objective To design gene microarray suitable for genotyping extensive SNPs involved in NSCL/P. Methods Direct sequencing was used to ensure the accuracy of gene microarray results. In order to ensure the repeatability of gene microarray results, some samples were tested three times. Results In this study, we designed an efficient, rapid, convenient, highly parallel, and inexpensive gene microarray that is based on allele-specific primer extension and suitable for genotyping SNPs involved in NSCL/P. Conclusion It is a new, sensitive, simple method for NSCL/P gene diagnosis in clinic.

[Key words]Gene microarray; Allele-specific primer extension; NSCL/P; SNP

收稿日期：（2015-10-29）

[基金項目]遼寧省科技攻關項目（2009225007-7）▲通訊作者

[中圖分類號]R782.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1673-9701（2016）02-0076-03