藍莓組織培養技術研究進展

羅蘭艷　范淑芳　簡大為

摘要：本文對近幾十年來的藍莓組織培養技術進行綜述，主要介紹了外植體的準備、培養基的選擇、增殖及繼代培養、生根培養和試管苗的移栽馴化等。

關鍵詞：藍莓；組織培養；研究進展

中圖分類號：S663.9文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2016）01-0031-05

Abstract： We focused on recent advances in tissue culture of blueberry.The tissue culture of preparing explants，selecting of cultivation media， proliferation and subculture， rooting cultivation， transplanting and domestication of testtube plantlets were mainly introduced in this view.

Key words：blueberry；tissue culture；summary

藍莓又名越橘、藍漿果。杜鵑花科Ericaeae 越橘屬Vaccinium的多年生小灌木。藍莓果皮薄，酸甜味美，有獨特風味和豐富的營養，被稱為“漿果之王”[1]。藍莓果實中含有多種生理活性成分如花色素苷、黃酮等，經常食用藍莓可以有效地防止腦神經衰老和糖尿病等多種疾病的發生[2]，同時，食用藍莓還具有增強心臟功能、明目以及抗癌等獨特功效[3-4]。因此，藍莓被聯合國糧農組織列為五大健康食品之一[5]，已成為21 世紀最具發展前景的經濟作物之一[6]。

在栽培上藍莓屬小漿果類果樹，原產地和主產地均在北美洲，但廣泛分布于北半球。藍莓在我國約有 91 個種 28 個變種，主要分布于東北和西南地區[7]。目前， 商業化種植的藍莓品種主要有四大類：矮叢藍莓、半高叢藍莓、高叢藍莓和兔眼藍莓。其中高叢藍莓主產于北美洲溫帶及亞熱帶，具有果實大、產量高、品質好等諸多優良品質，是全球最重要的商業化栽培種[8]。近幾年來，高叢藍莓又進一步被分為“南高叢藍莓”和“北高叢藍莓”兩個亞類群[9]。

早在100多年前，美國人就開始了藍莓的選育工作，到1937年就已經篩選出15個品種并進行了商業化的栽培[10]；到20世紀80年代，在全美境內就已選育出優良品種100多個，并分別在美國南部、東部、北部均形成了藍莓產區[9-10]；進入21世紀，藍莓就成為了美國主栽經濟林之一。繼美國之后，世界各國都開始引種栽培藍莓，開展適合本國的藍莓栽培技術研究和選育工作，并相繼進入商業化栽培[11]。在亞洲，中國和日本是引種藍莓并進行商業化種植發展較快的國家。我國藍莓的應用最早可追溯至20世紀50年代，我國東北的‘篤斯藍莓Vaccinium uliginosum被用來釀酒，但在當時人們并沒有認識到藍莓特殊的保健功效，所以沒有對藍莓的栽培引種工作進行系統研究，藍莓也沒有被作為水果進行推廣和種植。直到20世紀80年代， 吉林農業大學郝瑞教授最先率隊對長白山地區的野生篤斯藍莓資源進行全面系統地調查研究[12]，并開始野生藍莓的馴化栽培。同時國內相關專家也積極開展藍莓的國外引種栽培工作，1983年郝瑞教授首次從美國引進10余個藍莓品種進行馴化栽培，此后國內多家科研單位、大專院校以及企業也陸續開展國外引種工作，對藍莓的引種馴化、土壤改良和栽培管理等做了大量的研究，并逐步推廣應用于生產[13]。

藍莓作為一種具有保健功能的新興水果逐漸被人們所接受，世界各國均十分重視藍莓產業的發展。組織培養技術在藍莓上的應用，對于藍莓種質資源保護和開發利用具有極為重要的意義。通過組織培養和脫毒技術，可以獲得比常規育苗更大量、更優質的種苗，滿足市場上對藍莓種苗的需求。對20世紀90年代以來藍莓組織培養技術的研究進行總結概述，可以為進一步研究藍莓的組織培養提供參考。

1外植體的準備

藍莓組織培養中外植體的選擇有很多，但大多數還是以幼嫩莖段和莖尖為主[14-15]，以葉片誘導不定芽為輔[16]，同時也有學者開展以子葉或上胚軸作為外植體誘導不定芽，以根作為外植體誘導植株再生的技術研究[17]。外植體選取后多采用70%～75%的酒精結合01%～05%的升汞、或1%～10%的次氯酸鈉、或5%～20%的雙氧水進行滅菌處理，均可獲得較為理想的滅菌效果[15，18-22]?，F有研究結果表明，以藍莓的莖段和葉片為外植體進行組織培養應用最為廣泛且效果最為理想。

2基本培養基的選擇

根據現在已有的報道，藍莓組織培養過程中所使用過的基本培養基種類較多，有MS培養基、1/2MS培養基、WPM培養基、改良WPM培養基、Anderson培養基、White培養基、Knops培養基、Z-2培養基和B5培養基等，研究結果顯示沒有一定之規，但均取得了較好的實驗結果[15，23-30]。根據現有研究結果，藍莓不同品種甚至同一品種不同的培養階段利于藍莓無菌苗生長的培養基均不相同，可能原因為藍莓不同品種間及同一品種不同發育階段的營養需求存在差異，在組織培養中應適當考慮。

3增殖及繼代培養

藍莓的增殖及繼代培養過程中的影響因子，研究最多的是不同種類不同濃度的細胞分裂素、生長素對增殖及繼代的影響。

3.1細胞分裂素的選擇

董朝莉認為，在藍莓莖段的離體增殖培養中，對其增殖培養影響較大的是細胞分裂素的種類和濃度，她的研究結果表明以加入1～2 mg·L-1 ZT或10～20 mg·L-1 2ip效果較好[18]；邵振中等認為，在兔眼藍莓的增殖培養中，在WPM培養基中加入20 mg·L-1 ZT+05 mg·L-1 IBA，增殖系數可以達到80[31]；王淑珍等認為，在南高叢藍莓的增殖培養中以加入1 mg·L-1 ZT為宜，在繼代培養中以交替使用1 mg·L-1 ZT和2 mg·L-1 ZT為宜[32]；Alena 等在Anderson培養基中加入05 mg·L-1ZT進行五種高叢藍莓的組織培養，最高的增殖系數達到了391[29] ；Lisa等比較了ZT、2ip和不添加激素對高叢藍莓葉片增殖的影響，結果表明ZT的作效果更明顯[35]。國內其他的相關研究也表明，藍莓的增殖和繼代培養中，ZT的作用效果最理想，甚至最高增殖系數可以達到50[19]。Barbara和Ana在改良WPM培養基中加入4 mg·L-1 ZT或10～15 mg·L-1 2ip均取得了成功，甚至有部分品種誘導成功率達100%[33]； Laura等和Line等分別在改良MS培養基和Z-2培養基上添加不同濃度的2ip進行藍莓增殖培養，結果表明隨著2ip濃度的增加增殖芽數增加[30，34]?，F有研究結果表明，細胞分裂素中05～20 mg·L-1的 ZT可能較有利于藍莓的組培增殖，較高濃度的 2ip也可促進藍莓增殖，而且隨著細胞分裂素濃度的增加增殖芽數也隨之增加，與組培理論相符。但考慮到有效苗率，細胞分裂素的濃度仍需適當控制。

3.2生長素的選擇

單獨研究生長素對增殖及繼代培養的影響的文獻較少， Han等比較IBA和NAA 對藍莓的增殖培養，結果表明IBA的效果要強于NAA[36]；Wojciech 和Magdalena比較了IBA和IAA對藍莓的增殖培養，結果表明IBA的效果要強于IAA [37]。在增殖培養過程中生長素的應用較為廣泛，邵振中等、朱宏芬等使用IBA[31，38]配合不同的細胞分裂素，增殖系數可達到5.8～8.0；陳平芬等、寧志怨等、Cao等使用NAA[39-41] 配合不同的細胞分裂素，增殖系數可達到3～4，Line等使用IAA[30] 配合2ip也取得了較好地效果。現有研究結果說明，生長素可能不為影響藍莓增殖的主導因子，IBA、NAA、IAA在藍莓增殖中均可取得較好的效果，但相對而言IBA效果可能更好。

3.3pH值的選擇

在pH值對增殖培養的影響上，普遍認為藍莓為酸性植物，所以組織培養的各階段，pH值的應用大多在4.8～5.6范圍內，而pH值對增殖培養的影響研究較少，廉家盛認為最適合‘美登增殖的培養基pH值為5.4[28]。Maria 等分別試驗了不同pH值 （40，45，50，55，60） 對藍莓增殖培養的影響，結果表明對于不同的藍莓品種最適宜的pH值不同，對‘Koralle最適宜 pH值為55，而對‘Red Pearl最適宜pH值為40[42]?，F有研究結果表明，藍莓組培中應根據不同品種的需求來選擇適宜的PH值，但總體而言以偏酸性為主。

4 試管苗的生根培養

4.1瓶內生根培養

從目前的研究可以看出，對于培養大多數采用1/2 WPM培養基添加不同濃度的IBA[43-45] ；也有人用其它培養基進行誘導生根取得了成功，Takuya等認為WPM是最合適的生根培養基[26]；Maria等用Anderson培養基也成功誘導生根[42]。

在IBA的使用濃度上，絕大多數認為是添加05 mg·L-1 IBA最有利于生根培養[31，43，46-48] 。但也有研究表明低濃度的IBA更有利于生根，孫書偉認為，“藍豐”在添加01 mg·L-1 IBA的培養基中，28 d后生根率可達100%；“伯克利”在添加005 mg·L-1 IBA的培養中，32 d后生根率也可以達到100%[49]。同時，也有研究表明高濃度的IBA更有利于生根培養，張彩玲認為，在添加10 mg·L-1IBA的培養基中，“美登”的生根率可以達951%[44]；約旦等、Maria等認為，誘導藍莓生根的最宜IBA濃度是20 mg·L-1[42，50]。還有研究表明，配合使用多種生長素更有利于生根培養。楊艷敏等認為，在相同條件下，使用單一的IBA，生根率最多可以達到6133%，但如果在添加05 mg·L-1 IBA的同時加入010～015 mg·L-1 NAA，生根效果更好，生根率可以達到6733%～7267%，且生根速度也快[43]。在pH值對藍莓生根的影響上，梁曉晶認為pH值對生根率影響顯著，且篤斯越橘的最佳生根培養基pH值為48～60[51]。綜合上述研究結果，說明影響藍莓生根的主導因子為生長素，而且不同品種間的需求不同，但多數學者認為IBA更有利于藍莓的生根培養，且少量學者認為IBA搭配少量的NAA可能更為利于藍莓生根。

4.2瓶外生根培養

目前大多數研究結果表明，藍莓瓶外生根培養技術較為成熟，在工廠化生產中大多使用瓶外生根培養。選用增殖培養的健壯幼枝，將培養基清洗干凈，用適當的生長調節劑處理后，扦插于適宜的生長基質中，給予其合適的外部生長條件，可以促進其快速生根。劉慶忠、姚平等認為，將試管苗幼枝用IBA快速處理后，扦插于腐苔蘚基質上，然后扣上小拱棚置于溫室中，小棚內濕度控制在85%～95%，20～28 ℃，培養20 d后就可以生根，并且長勢較好[52-53]。大多數的研究則表明，在外部環境控制較好的情況下，培養基質對瓶外生根的影響較大。張賢萍認為，在椰糠和水苔按體積比6∶4的混合基質中，誘導瓶外生根效果最好，其生根率高達96%以上[54]；王會認為，在苔蘚和河沙按體積比2：1的混合基質中，誘導瓶外生根效果最好，其生根移栽成活率可達到904%[55]；程淑云、黃國輝等認為，不同生根基質對瓶外生根率有較大影響，在苔蘚上生根率最高[56-57]。綜上所述，在藍莓進行瓶外生根培養時，應著重考慮培養基質與溫濕環境的影響，同時對試管苗幼枝配以適宜的生長素處理，可以達到較好的生根效果。利用瓶外生根技術可以減少瓶內生根的無菌操作過程，明顯節約人力和物力、降低生產成本，在組培生產中可以優先考慮。

5其它培養條件或添加物的選擇

在試管培養的增殖和生根階段，有研究學者也對培養過程中可能影響到增殖或生根的其他因素進行了探討。宋剛認為，藍莓在誘導生根的過程中，先進行7 d的暗培養再進行光照培養或增加繼代代數達到5代后，生根率均會明顯提高[58]。邵振中等認為光照強度對兔眼藍莓的增殖系數影響不大，但在小于2 000 Lx的光照強度下，玻璃化現象會隨光照加強而減弱，所以建議增殖培養光照強度為2 000～3 000 Lx[31]。邵振中、王平紅等均對活性炭對藍莓的生根進行了研究，邵振中等認為，活性炭對兔眼藍莓生根有抑制作用[31]；王平紅認為，在培養基中添加1%～2% 活性炭，有利于誘導藍莓生根，但當培養基中添加活性炭的用量超過2%時，并不利于其生根，生根率反而會下降[59]。現有研究結果說明，光照、活性炭等對不同品種藍莓的組培可能也有影響，在組培研究中應酌情考慮。

6試管苗的馴化移栽

藍莓試管苗的馴化移栽技術較為成熟。李京等認為，溫度對試管苗的移栽成活有較大影響，當溫度升高（<25 ℃）時，有利于移栽成活；研究結果表明，9～10月是移栽的最佳季節，控制馴化室溫度25 ℃、溫度75%、遮光30%的條件下，將試管苗用500 mg·L-1的ABT處理30 s后栽于1∶1的沙子和草炭土的混合基質中，移栽成活率可達到970%[60]。董朝莉對藍莓移栽馴化進行了對比試驗后認為，季節和空氣濕度對移栽成活率影響較大，她認為春秋季節是適合移栽的季節、當空氣濕度達94%～98%時也明顯有利于成活率，在生產中可在苗床上再搭一小拱棚并覆蓋一層透明薄膜[18]。此外，國內對移栽基質的試驗研究較多，得出適合藍莓移栽的基質也較多，有園土、腐殖土、廢苔蘚按1∶3∶1比例的混合基質[44]；有腐殖菌根土、珍珠巖按3∶2比例的混合基質[61]；有純腐苔蘚[14，32]等。綜上所述，藍莓試管苗的馴化移栽技術與其瓶外生根技術相類似，應著重考慮培養基質及光照、溫度、濕度等環境條件的影響，同時配以適宜的生根劑處理，可以達到更好的效果。

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（責任編輯：鄭京津）