膠束增敏熒光法測定大鼠血清中蓽茇寧

領　小,苗　澍,敖登高娃

(內蒙古大學　化學化工學院,內蒙古　呼和浩特　010021)

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膠束增敏熒光法測定大鼠血清中蓽茇寧

領小*,苗澍,敖登高娃

(內蒙古大學化學化工學院,內蒙古呼和浩特010021)

摘要：蒙藥蓽茇有效成分蓽茇寧具有熒光,且熒光可被表面活性劑吐溫-20增敏,同時,其同步熒光光譜能消除血清樣品的背景熒光對蓽茇寧熒光光譜的干擾,據此建立了直接測定大鼠血清中蓽茇寧濃度的新方法。蓽茇寧的線性范圍為5.47×10-3~3.28 μg·mL-1,檢出限為1.20×10-3μg·mL-1,樣品回收率為100.6%,相對標準偏差為2.7%。方法可用于大鼠血清樣品中蓽茇寧濃度的直接測定。

關鍵詞：蓽茇寧；膠束體系；熒光分析法；血清

蓽茇(Piper longum L.)為胡椒科植物蓽茇的未成熟果穗,是常用蒙藥。蓽茇寧(Piperlonguminine,GBN)是蓽茇的活性成分之一,具有降血脂活性[1-2]。作為藥物,蓽茇寧只有被血液吸收才能產生降血脂作用。血液中蓽茇寧的濃度決定了其藥效和毒理,因此建立生物樣品中蓽茇寧含量的有效測定方法十分必要。目前,蓽茇寧的分析測定方法有分光光度法[3]、熒光光譜法[4]和高效液相色譜法[5]等。近年來,熒光法廣泛應用于藥物分析工作中[6-7]。但由于生物樣品中內源性熒光物質的干擾,直接測定生物樣品中蓽茇寧濃度的熒光光譜方法尚未見文獻報道。本文對蓽茇寧的熒光特性進行了研究,建立了檢測生物樣品血清中蓽茇寧的熒光分析方法。該方法操作簡便,靈敏度高,選擇性好,為蓽茇寧的臨床藥物濃度測定和藥代動力學研究提供了方法學基礎。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

F-3010型熒光分光光度計(日本日立公司)；pHS-3C 型酸度計(上海第二分析儀器廠)；TGL-16G冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。

蓽茇寧標準品(99.9%)乙醇溶液；Mcllvaine(Na2HPO4-C6H8O7)緩沖溶液,pH 6.5；0.01 mol·L-1吐溫-20溶液；血清樣品為10 000 r/min下離心5 min所得。實驗所用的其它試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

1.2實驗方法

在10 mL比色管中,依次加入一定量的蓽茇寧溶液、0.5 mL吐溫-20溶液與2.0 mL Mcllvaine緩沖溶液,用水稀釋至刻度,搖勻,放置10 min。用1 cm的石英熒光池,在λex/λem=344/464 nm處測定熒光強度,激發及發射狹縫寬度均為5 nm。

圖1　蓽茇寧的熒光發射光譜Fig.1　Emission spectrum of GBN1.0.5 mmol·L-1 Tween-20;2.1.37 μg·mL-1 GBN;3.GBN- Tween-20

圖2　 pH值對體系熒光強度的影響Fig.2　Effect of pH value on fluorescence intensity

2結果與討論

2.1發射光譜

蓽茇寧乙醇溶液在激發波長為 340 nm、發射波長為472 nm 處具有熒光,但熒光較弱且不穩定。表面活性劑形成的膠束微環境對物質熒光有增敏作用[8],加入表面活性劑吐溫-20后,體系在λex/λem=344/464 nm處的熒光強度增加、穩定性升高,在最大發射波長處幾乎無干擾(圖1)。且隨著體系中蓽茇寧濃度的增加,熒光強度在一定濃度范圍內呈線性增強。因此,該體系可用于熒光分析法測定蓽茇寧。

2.2緩沖溶液及pH值的影響

溶液的pH值將會影響體系的光譜性質[9]。考察了在Mcllvaine、Britton-Robinson等緩沖溶液體系中不同pH值對體系熒光強度的影響(見圖2)。結果表明,pH 6.0~7.5的 Mcllvaine緩沖體系中,緩沖溶液的用量為1.5~2.5 mL時,熒光強度最大且穩定,因此實驗選取Mcllvaine緩沖溶液,其pH 值為6.5,用量為2.0 mL。

2.3表面活性劑及用量的選擇

考察了表面活性劑溴化十六烷基三甲基銨(CTMAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(DSS)、OP -10、曲拉通X-100及吐溫-20等的熒光增敏作用。結果發現,吐溫-20的增敏、增穩作用最顯著,其用量為0.3~0.7 mL時效果最佳。用量小于0.3 mL時,增敏效果不明顯；用量大于0.7 mL時,體系熒光光譜出現雜峰,基線上升,干擾測定。故選用0.5 mL吐溫-20溶液進行后續實驗。

2.4試劑加入順序的影響

在選定實驗條件下,考察了試劑加入順序對蓽茇寧體系熒光強度的影響。實驗發現,試劑加入順序為蓽茇寧、吐溫-20溶液、Mcllvaine緩沖溶液時,體系的熒光強度最大且恒定。故選擇此順序加入試劑。

2.5離子強度的影響

選用NaCl溶液考察了離子強度對體系熒光強度的影響。結果表明,當體系中 NaCl 的濃度小于0.585 mg·mL-1時,體系的熒光強度基本不變;NaCl 濃度大于0.585 mg·mL-1時,體系的熒光強度顯著下降。這可能是由于大量存在的Na+和Cl-對膠束體系的穩定性產生影響,因此實驗過程中未加入NaCl溶液,以保持較低的離子強度。

圖3　空白血清與標樣的熒光發射光譜Fig.3　Emission spectra of blank serum and standard solution1.blank serum-Tween-20;2.GBN- Tween-20

2.6干擾離子的影響

3樣品分析

3.1常規熒光光譜

在 10 mL 比色管中,分別加入1.0 mL空白血清和蓽茇寧乙醇溶液,再加入0.5 mL吐溫-20溶液,掃描激發波長為 344 nm,按實驗方法在400~600 nm 范圍內掃描熒光發射光譜(圖3)。結果發現,蓽茇寧與血清樣品的熒光光譜出現重疊,采用常規熒光光譜難以準確測定血清樣品中的痕量蓽茇寧。

3.2同步熒光光譜

同步熒光法在不分離情況下能解決生物樣品與目標物的熒光重疊問題[10-11]。本實驗中,分別掃描波長差Δλ=120 nm時血清樣品及蓽茇寧的同步熒光光譜(圖4A),發現基本消除了血清樣品的背景干擾。在pH 6.5的吐溫-20膠束體系中,隨著蓽茇寧濃度的增加,體系同步熒光強度在一定范圍內呈線性增強(圖4B)。故同步熒光光譜法可用于血清中蓽茇寧濃度的測定。

3.3Δλ的選擇

同步熒光技術最大的影響因素是Δλ,它直接影響著方法的靈敏度與選擇性[12]。本文分別考察了Δλ為0,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160 nm時血清樣品和蓽茇寧混合體系的同步熒光光譜,發現Δλ=120 nm時蓽茇寧與血清中熒光物質的分辨率最高,熒光信號最強。因此本實驗選擇Δλ=120 nm。

3.4標準曲線與精密度

于10 mL比色管中加入1.0 mL血清樣品及一定量蓽茇寧、0.5 mL吐溫-20和2.0 mL緩沖溶液,稀釋至刻度。設置Δλ=120 nm,在220~450 nm波長范圍內進行同步熒光光譜掃描。結果表明,蓽茇寧的質量濃度(ρ,μg·mL-1)在5.47×10-3~3.28 μg·mL-1范圍內與體系熒光強度(IF)呈良好的線性關系,線性方程為IF=33.008ρ+114.44,相關系數(r)為0.999 6。對空白對照液進行11次平行測定,根據公式cL=3s/k(s為空白溶液的標準偏差,k為標準曲線斜率),計算得檢出限為1.20×10-3μg·mL-1。對濃度為1.37 μg·mL-1的蓽茇寧溶液平行測定11次,相對標準偏差(RSD)為1.3%,表明該方法的精密度良好。

3.5血清樣品中蓽茇寧的回收率

3.5.1新生牛血清中蓽茇寧的回收率測定取新生牛血清樣品(北京元亨圣馬生物技術研究所)適量,10 000 r/min離心5 min,使其雜質沉淀完全。取適量上清液,按照標準曲線繪制方法進行蓽茇寧濃度及加標回收率的測定,結果見表1。新生牛血清中未測出蓽茇寧,方法的加標回收率為98.9%~100%,表明該方法精確可行。

表1　新生牛血清樣品中蓽茇寧的測定結果(n=5)

*：no detected

3.5.2大鼠血清中蓽茇寧的回收率測定Wistar雄性大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號為SCXK(京)2012-0001),體重為(200±20) g。用0.5%的CMC-Na將蓽茇寧制成混懸液,按100 mg·kg-1劑量灌胃給大鼠,大鼠每200 g體重灌胃1 mL蓽茇寧混懸液,連續灌胃3 d。末次給藥后2 h股動脈取血,放置30 min。3 000 r/min離心15 min,取上清液,進行蓽茇寧濃度及加標回收率的測定,結果顯示大鼠給藥2 h的血清中蓽茇寧的濃度達1.04 μg·mL-1,加標回收率為100.6%,RSD為2.7%。表明該方法靈敏度高,能夠測定血清中的蓽茇寧。

4結論

基于pH 6.5的緩沖溶液中,蓽茇寧的熒光強度可被表面活性劑吐溫-20增敏的特性,建立了一種快速靈敏的蒙藥中有效成分蓽茇寧的熒光測定方法。血清樣品的本底熒光與蓽茇寧的熒光光譜重疊,而選擇Δλ=120 nm進行同步熒光光譜分析可實現二者的分離,從而基本消除血清樣品的背景干擾。據此提出直接測定大鼠血清中蓽茇寧濃度的同步熒光光譜法,加標回收率為100.6%,RSD為2.7%。該法簡便、快速、靈敏度高、選擇性好,為蓽茇寧的生物體內直接檢測提供了可能,對蓽茇寧血清藥物的化學研究具有重要意義。

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Determination of Piperlonguminine in Rat Serum Using Micelle Sensitized Fluorescence Spectrometry

LING Xiao*,MIAO Shu,AODENG Gao-wa

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Inner Mongolia University,Hohhot010021,China)

Abstract：Piperlonguminine,the effective composition of the Mongolian medicine Piper longum L.,has fluorescence and its fluorescence signal could be greatly enhanced by the surfactant Tween -20.The synchronous fluorescence spectroscopic method could eliminate the interference of the background fluorescence from serum samples on fluorescence spectra of piperlonguminine.According to this technique,a method was established for the determination of piperlonguminine in rat serum.The linear range of this method was in the range of 5.47×10-3-3.28 μg·mL-1,the detection limit for piperlonguminine was 1.20×10-3μg·mL-1,and the relative standard deviation(RSD) was 2.7%.The method was successfully applied in the detection of piperlonguminine in rat serum amples,with recovery of 100.6%.

Key words：piperlonguminine;micellar system;fluorescence spectrometry;serum

中圖分類號：O657.3;TQ460.72

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0225-05

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.015

*通訊作者：領小,博士,副教授,研究方向：藥物分析,Tel：0471-4992511,E-mail:lingxiaobao@126.com

基金項目：國家自然科學基金項目(81060366)；內蒙古自然科學基金項目(2014MS8024)

收稿日期：2015-07-10；修回日期：2015-08-19