茶葉咖啡堿的研究進(jìn)展

陳宇宏，王 振，文 祎，黃建安，劉碩謙，劉仲華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

茶葉咖啡堿的研究進(jìn)展

陳宇宏，王 振，文 祎，黃建安，劉碩謙*，劉仲華*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

從咖啡堿的生物合成、分解代謝、提取純化、分析檢測(cè)和生物活性五個(gè)方面進(jìn)行了綜述。

咖啡堿；生物合成；代謝；生物活性

咖啡堿是一種無(wú)色針狀結(jié)晶的含氮化學(xué)物，略帶苦味，分子式為C8H10N4O2。茶葉中咖啡堿的含量通常在3%～5%，隨茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育條件及品種不同而有所差別，一般芽中含量最高。咖啡堿也是茶葉的重要滋味物質(zhì)，對(duì)品質(zhì)有較大的影響，且其含量高低與茶葉品質(zhì)成正相關(guān)，品質(zhì)越好，內(nèi)含咖啡堿的含量一般越高。

1　咖啡堿的生物合成

咖啡堿的生物合成過(guò)程中，一是需要嘌呤環(huán)的來(lái)源，二是需要甲基供體。關(guān)于咖啡堿的合成途徑大多是通過(guò)對(duì)咖啡果和茶樹(shù)的研究得來(lái)的。咖啡堿的嘌呤環(huán)骨架來(lái)源于嘌呤核苷酸，Ashihara和Suzuki［1］在大量研究基礎(chǔ)上，將咖啡堿的合成途徑分成了兩個(gè)部分：核心途徑和供體途徑。

1.1核心途徑

咖啡堿的生物合成核心途徑是以黃嘌呤核苷作為起始底物，并經(jīng)過(guò)三步甲基化和一步核苷降解反應(yīng)而最終合成。Suzuki等［2］指出在茶樹(shù)和咖啡樹(shù)中，咖啡堿是由黃嘌呤核苷（Xanthosine）→7-甲基黃嘌呤核苷（7- methyl xanthine nucleotide）→7-甲基黃嘌呤（7- methyl xanthine ）→3、7-二甲基黃嘌呤核苷（3， 7-two methyl xanthine ）（俗稱(chēng)可可堿）→1、3、7-三甲基黃嘌呤核苷（1， 3， 7- three methyl xanthine）（俗稱(chēng)咖啡堿）路徑合成。Ashihara 等［8］在咖啡樹(shù)葉片中利用同位素示蹤實(shí)驗(yàn)證明了這條路徑。Negishi等［3］從茶樹(shù)葉片中獲得7-NMT （Xanthosine methyltransferase/7-methylxanthosinesynthase，黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶），其被證實(shí)是催化黃嘌呤核苷轉(zhuǎn)化成7-甲基黃嘌呤核苷的酶。Mizuno等［4］克隆了該酶全長(zhǎng)基因CmXRS1，并驗(yàn)證出其有N-甲基轉(zhuǎn)移酶活性。Kato［5］等從茶樹(shù)嫩葉中獲得了TCS（tea caffeine synthase，茶樹(shù)咖啡堿合成酶），催化咖啡堿合成的最后兩步反應(yīng)，對(duì)1，7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤和可可堿都顯示了高催化活性。隨后Kato等［6］克隆出該酶的編碼cDNA，TCS1，其主要催化嘌呤環(huán)的3位和1位N-甲基化。

1.2供體途徑

在供體途徑中，有多種來(lái)源可以最終合成黃嘌呤核苷，從而為核心途徑提供起始甲基受體。目前已發(fā)現(xiàn)至少4條路徑：腺嘌呤核苷酸路線(xiàn)［7］、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸路線(xiàn)［2］、嘌呤環(huán)從頭合成路線(xiàn)［8］和S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)路線(xiàn)［9］，其中腺嘌呤核苷酸路線(xiàn)是最重要的途徑。馮艷飛等［10］首次克隆得到SAM（S-adenosyl methionine，茶樹(shù)S-腺苷甲硫氨酸合成酶）基因cDNA，其預(yù)測(cè)氨基酸序列與其他物種的SAM合成酶有超過(guò)90%的同源性，SAM在S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)路線(xiàn)中起重要的作用，且茶樹(shù)中黃嘌呤核苷主要來(lái)源于此循環(huán)途徑。IMPDH（Inosine monophosphate dehydrogenase，次黃嘌呤核苷酸脫氫酶）是催化IMP轉(zhuǎn)化為XMP的關(guān)鍵酶，Keya等［11］首次克隆得到IMPDH基因編碼cDNA，TIDH （EU106658），并證明其在咖啡堿合成途徑中起關(guān)鍵作用。

1.3茶樹(shù)中咖啡堿非主要合成途徑

在茶樹(shù)中另有其余非主要途徑，如補(bǔ)救途徑是茶葉堿通過(guò)3-甲基黃嘌呤、可可堿而最終合成咖啡堿［7］。Kato 等［12］在探究茶樹(shù)嫩葉中N-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性后，提出了另一種非主要路徑，即7-甲基黃嘌呤→1、7-二甲基黃嘌呤（擬黃嘌呤）→咖啡堿。

2　咖啡堿的分解代謝

咖啡堿產(chǎn)生于嫩葉和未成熟的果實(shí)中，并在這些器官的成熟過(guò)程中逐漸積累，在這之間咖啡堿會(huì)逐漸降解三甲基，從而最終形成黃嘌呤。在咖啡葉中咖啡堿代謝首先由Kalberer［13］報(bào)道。自那時(shí)以來(lái)，若干使用的14C嘌呤生物堿示蹤實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被報(bào)道［14-18］，表明主要的分解代謝途徑是咖啡堿→茶葉堿→3-甲基黃嘌呤→黃嘌呤。黃嘌呤隨后進(jìn)入傳統(tǒng)的嘌呤降解途徑，首先在黃嘌呤氧化酶的作用下，氧化成尿酸，它的進(jìn)一步分解因不同種類(lèi)的生物體內(nèi)有關(guān)分解酶是否存在而異。人和動(dòng)物體內(nèi)分解尿酸的能力較低，常以尿酸為最終產(chǎn)物。而植物體內(nèi)因廣泛地存在著尿囊素酶、尿囊酸酶和尿酶等一系列酶，因此能繼續(xù)分解尿酸，并最終分解成氨和二氧化碳。咖啡堿降解為茶葉堿是整個(gè)降解過(guò)程的限速步驟［6，19-20］。

3　咖啡堿的提取純化

在早期的研究中，提取咖啡堿的方法已有多種，如溶劑法、升華法、離子沉淀法、柱層析法、超臨界CO2法和微波萃取法。近年來(lái)，人們將提取咖啡堿的方法不斷優(yōu)化。尹志芳等［21］采取超臨界CO2萃取技術(shù)提取益陽(yáng)黑茶中的咖啡堿，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得咖啡堿的最佳萃取條件為：萃取溫度40℃，萃取壓力20 MPa，固定萃取時(shí)間2 h，夾帶劑采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，適宜用量為300 mL/150 g，咖啡堿產(chǎn)率為（0.457±0.036）%。王立升等［22］用福建烏龍茶為原料，以超聲-微波協(xié)同萃取法為實(shí)驗(yàn)方法，探討了提取咖啡堿的最優(yōu)條件。結(jié)果表明，在微波功率500 W、加熱時(shí)間4 min、乙醇濃度90%、提取溫度90℃、料液比1∶20 g/mL時(shí)為最優(yōu)條件。在此條件下，咖啡堿產(chǎn)率2.60%，純度（94±0.4）%。李振武［23］采用二級(jí)樹(shù)脂吸附層析法對(duì)茶多酚與咖啡堿進(jìn)行分離與純化，通過(guò)對(duì)離子交換樹(shù)脂及大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行篩選，最終選定NKA-Ⅱ樹(shù)脂作為第二級(jí)吸附樹(shù)脂用于咖啡堿的回收，回收的咖啡堿副產(chǎn)品的純度為46.5%，若將此咖啡堿進(jìn)行二次升華后，其純度可達(dá)97.5%。周順珍等［24］以GB/T8313-1987水浸出方式作為樣品的提取方法對(duì)7種兒茶素組分及咖啡堿進(jìn)行HPLC測(cè)定，對(duì)比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8313-2008提取樣品，此操作更簡(jiǎn)單、方便，且效率高。

4　咖啡堿的分析檢測(cè)

除常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室定量檢測(cè)咖啡堿的方法如碘量法、比色法、定氮法、紫外分光光度法等外，近年來(lái)，因?yàn)樯V法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，被廣泛應(yīng)用于咖啡堿的含量檢測(cè)中［25］。許禎毅［26］對(duì)采用HPLC測(cè)定武夷巖茶中咖啡堿含量的影響因素和條件進(jìn)行探討，結(jié)果表明茶葉樣品中咖啡堿含量與峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，且在MgO添加量為0.5 g、沸水浴中浸提時(shí)間為30 min時(shí)，測(cè)得咖啡堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%，加標(biāo)回收率為92%～102%，此方法能應(yīng)用于不同武夷巖茶品種中咖啡堿的檢測(cè)。張琪等［27］用等度洗脫法對(duì)茶葉中6種兒茶素及限量成分咖啡堿的HPLC定量測(cè)定，結(jié)果顯示此方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。褚利平等［28］建立了紅茶中咖啡因含量的HPLC測(cè)定方法，并表示用此方法可鑒別藥材真?zhèn)危⒖刂扑幉馁|(zhì)量。郭穎等［29］利用UPLC對(duì)咖啡堿的含量進(jìn)行了分析，并表示此方法相較HPLC的分析時(shí)間大大縮短，僅需6 min。另外，宋爽等［30］用低pH沉淀法檢測(cè)了茶葉中的結(jié)合咖啡堿，結(jié)果顯示普洱茶（熟茶）水提物中的結(jié)合咖啡堿含量最高，而綠茶和紅茶水提物中只有極少量的咖啡堿為結(jié)合態(tài)。

5　咖啡堿的生物活性

5.1抗癌與治療腫瘤

在人們發(fā)現(xiàn)咖啡堿與癌癥、腫瘤的關(guān)系之前，咖啡堿因能興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)而被應(yīng)用于抗疲勞、抗焦慮等癥狀中［31-32］。至今國(guó)內(nèi)外已有許多報(bào)道證實(shí)，咖啡堿的攝入量對(duì)于癌癥及腫瘤有一定的防治作用。Hildebrand等［33］在26年間對(duì)968432人的隨訪(fǎng)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于不喝或偶爾喝咖啡的人，每天喝含咖啡堿的咖啡多于4杯的人，口咽癌死亡風(fēng)險(xiǎn)降低49%，這表明咖啡堿的攝入量與口咽癌死亡率呈負(fù)相關(guān)。李越等［34］以86例子宮內(nèi)膜癌患者作為研究對(duì)象，對(duì)比了輔以咖啡堿治療的患者與不輔以咖啡堿治療的患者在經(jīng)過(guò)紫杉醇聯(lián)合順鉑二聯(lián)化療方法治療后的子宮內(nèi)膜組織雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及p21的蛋白表達(dá)水平，以及血清CA -125水平，發(fā)現(xiàn)輔以咖啡堿治療的患者的這些指標(biāo)增加更明顯。范耀東［35］觀察了以不同濃度和作用時(shí)間的咖啡堿對(duì)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，初步證明了咖啡堿在體外可以抑制U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性并在一定濃度范圍內(nèi)（1～10 mM）可促使其凋亡。

5.2防治阿爾茨海默病

咖啡堿對(duì)于大腦皮層的興奮作用尤為顯著，有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)于阿爾茨海默病等神經(jīng)疾病存在潛在的預(yù)防作用［36］。Maia 等［37］通過(guò)對(duì)實(shí)例的分析，利用回歸分析方法，表示在一定范圍內(nèi)，咖啡堿攝入量高低與患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)有顯著的負(fù)相關(guān)。Santos 等［38］在2005年至2008年間對(duì)1999年至2003年間招募的648人的隨訪(fǎng)中發(fā)現(xiàn)，咖啡堿與女性認(rèn)知能力下降之間呈負(fù)相關(guān)，但對(duì)于男性沒(méi)有明顯關(guān)系。Dall'lgna等［39］提供了第一個(gè)體外證據(jù)，表明腺苷A2A受體可以作為一個(gè)指標(biāo)，證明攝入咖啡堿能有益于阿爾茨海默病的治療。研究顯示［40］：每天適當(dāng)攝入咖啡堿可能延遲阿爾茨海默病的發(fā)生或降低患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)。

5.3防治帕金森病

大多數(shù)研究表明，咖啡堿與帕金森病呈負(fù)相關(guān)，且此關(guān)系對(duì)性別無(wú)明顯差異［41］，并有結(jié)果表明，咖啡堿對(duì)帕金森病患者有一定的保護(hù)作用［42］，當(dāng)咖啡攝入量約為每天3杯時(shí)，其保護(hù)作用達(dá)到最大值。

5.4治療早產(chǎn)兒原發(fā)性呼吸暫停

咖啡堿是呼吸系統(tǒng)的刺激藥物，是治療早產(chǎn)兒呼吸暫停的常用手段之一［43］。王曉敏等［44］以42例早產(chǎn)兒原發(fā)性呼吸暫停患兒為觀察對(duì)象，在給予枸櫞酸咖啡因規(guī)范治療后，發(fā)現(xiàn)患兒呼吸暫停平均每天發(fā)作次數(shù)明顯減少、嚴(yán)重程度降低。魏彥敏等［45］探討了咖啡因聯(lián)合藥物治療超低出生體質(zhì)量?jī)汉粑鼤和５淖罴褎┝浚蛣┝拷M（5 mg/kg）治療效果略高于高劑量組（8mg/kg）治療效果，且減少了大劑量使用所致的不良反應(yīng)事件的發(fā)生。但也有研究顯示，枸櫞酸咖啡因在使用期間會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的耗氧量增加、患兒體重增長(zhǎng)減慢，提示在應(yīng)用該藥時(shí)需適當(dāng)增加患兒的熱量攝入［46］。

6　結(jié)語(yǔ)

咖啡堿在茶樹(shù)體內(nèi)核心途經(jīng)和供體途徑中參與酶的合成以及調(diào)控作用已基本明晰。然而，咖啡堿的合成并非只受咖啡堿合成酶控制，在整個(gè)咖啡堿的合成代謝途徑中，任何一種酶都有可能對(duì)可可堿、咖啡堿等嘌呤堿的含量產(chǎn)生影響。即便獲得足夠多的遺傳信息，在技術(shù)不成熟的茶樹(shù)遺傳化領(lǐng)域還有很多問(wèn)題需要解決。

茶樹(shù)體內(nèi)的咖啡堿代謝途徑是復(fù)雜而且多樣化的，未來(lái)可以更多的發(fā)掘咖啡堿合成與分解代謝途徑酶基因信息，為之后的茶樹(shù)新品種選育特別是低咖啡堿茶樹(shù)品種選育奠定良好的基礎(chǔ)。

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Research Progress on Caffeine

CHEN Yu-hong，WANG Zhen，WEN Yi，HUANG Jian-an，LIU Shuo-qian*，LIU Zhong-hua*
（Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education， Hunan Agricultural University， National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals， Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha 410128， China）

This paper reviewed the progresses in the caffeine biosynthesis， catabolism of caffeine， caffeine extraction and purifcation， caffeine and caffeine analysis and detection of biological activity.

Caffeine， Biosynthesis， Metabolism， Biological Activity

S571.1

A

1009-525X（2016）03-03-07

2016-05-17

2016-06-14

陳宇宏（1992-），女，湖南長(zhǎng)沙人，在讀碩士研究生，研究方向：茶葉功能成分化學(xué)。

劉碩謙，shqianliu@sina.com；劉仲華，Larkin-liu@163.com