不同時間頭針對MCAO大鼠腦皮質JAK2/STAT5信號通路的影響*

梁 超，陳邦國，王靜芝，姜 濤

(1.海口市中醫醫院，海南海口 570216;2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，武漢 430000)

不同時間頭針對MCAO大鼠腦皮質JAK2/STAT5信號通路的影響*

梁 超1，陳邦國2，王靜芝2，姜 濤1

(1.海口市中醫醫院，海南海口 570216;2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，武漢 430000)

目的:觀察不同時間頭針對MCAO大鼠腦皮質JAK2/STAT5信號通路的影響。方法:將100只SD大鼠按隨機數字表法分為正常對照組和假手術組各10只，模型組和頭針組各40只，采用大腦中動脈線栓法(MCAO)制備模型，電針頭穴“頂顳前斜線”、“頂顳后斜線”進行治療。HE染色觀察腦皮質病理形態，ELISA檢測IL-6含量，Western Blotting法檢測腦皮質P-JAK2、PSTAT5蛋白含量。結果:HE染色后見神經元和膠質細胞腫脹、縮小、變形，胞漿嗜伊紅濃染，胞質疏松，微血管損傷，頭針后損傷明顯減輕;除IR 24 h外，頭針組IL-6含量均多于模型組，特別是IR 48 h差異最明顯;IR 12 h和IR 72 h，頭針組P-JAK2蛋白含量較模型組明顯增多;頭針后MCAO大鼠P-STAT5蛋白表達較模型組增加明顯。結論:頭針能有效減輕腦缺血再灌注大鼠缺血局部腦皮質的早期炎癥反應，這可能與其促進JAK2/STAT5信號通路磷酸化有關。

MACO大鼠;頭針;IL-6;P-JAK2;P-STAT5

JAK-STAT信號途徑是一條多種細胞因子共用作用的傳導通路，大腦缺血缺氧后參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等生物學過程［1-2］。通過調控JAK2/STAT5信號通路可以影響神經元、膠質細胞、血管內皮細胞等凋亡、增殖和分化，由此保護神經元，減輕炎癥反應，促進神經功能重塑，以修復缺血腦組織的損傷［3］。本實驗以此理論為基礎，觀察頭針治療后缺血腦皮質中 IL-6含量變化和JAK2/STAT5信號通路的激活情況，探討頭針療法減輕腦缺血再灌注損傷可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年清潔級SD大鼠100只(華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK (鄂)2014-0009)，雌雄不拘，體質量(200±20)g。于實驗前1周一次性購進，飼養于安靜、溫暖且避強光的環境中，室溫(20±2)℃，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 P-JAK2兔抗大鼠多克隆抗體、P-STAT5兔抗大鼠多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔抗體(以上抗體均購自KPL公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白抽提試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、PMSF(苯甲基磺酸氟100 mM)、磷酸化蛋白酶抑制劑、麗春紅染液、考馬斯亮藍G250染液、抗體洗脫液、顯影定影液(均購自谷歌生物)，超敏ECL化學發光試劑盒BeyoECL Plus(碧云天生物技術研究所)，牛血清白蛋白(Roche，北京索萊寶科技有限公司)，蛋白Marker(10-170 kDa，Fermentas)，白細胞介素-6(IL-6)雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(美國Sigma公司)。

1.2.2 主要儀器 電泳儀(北京市六一儀器廠，型號DYY-6C)、轉移電泳儀槽(北京市六一儀器廠，型號DYCZ-400D)、垂直電泳槽(北京市六一儀器廠，型號DYCZ-24DN)、臺式離心機(上海安亭科學儀器廠，型號TGL-16c)、磁力攪拌棒(常州澳華儀器有限公司，型號79-1)、脫色搖床(北京六一儀器廠，型號WD-9405A)、水浴鍋(姜堰市天力醫療器械廠有限公司，型號TL-420D)、暗匣(廣東粵華醫療器械廠有限公司，型號AX-Ⅱ)。

1.3 分組

100只SD大鼠按隨機數字表法分為模型組(按缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h分4個亞組)、頭針組(按以上缺血再灌注時間分別加頭針刺激，分4個亞組)，每個亞組10只，假手術組和正常對照組各10只。

1.4 模型制備方法

參照Longa［4］線栓法加以改進，制備MCAO模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，稱重，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉;仰臥固定于手術臺，常規備皮消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下筋膜和肌肉，暴露并分離出右側頸總動脈(Common carotid arternal，CCA)、頸內動脈(Internal carotid artery，ICA)、頸外動脈(External carotid artery，ECA)。電凝ECA的分支，結扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動脈(Pterygo palatine artery，PPA)，并在其起始部和CCA的近心端各置一動脈夾。將ECA殘端輕拉向下剪0.2 mm小口，輕推尼龍線尾端經CCA分叉部沿ICA入顱至大腦中動脈(Middle cerebral artery，MCA)，在線栓經 MCA和PPA分叉處時用玻璃分針調整方向，以便線栓順利進入MCA。尼龍線插入深度由CCA分叉部計約18 mm。栓塞60 min拉出尼龍線，使血流再灌。縫合切口，切口處涂灑青霉素粉并用碘酒消毒。手術后大鼠室溫下禁食給水喂養，蘇醒后進行神經功能障礙評分以判斷是否造模成功。只有神經功能障礙在1級以上的大鼠保留。

1.5 治療方法

根據中國針灸學會制定的《頭皮針穴名國際標準化方案》，選取雙側頂顳前斜線、頂顳后斜線，并結合《實驗針灸學》大鼠穴位圖譜模擬人體經穴定位。頂顳后斜線:“百會”(頂骨正中點)至“曲鬢”(為耳緣直上與耳尖水平線的交點);頂顳前斜線:頂顳后斜線向前平移0.1寸。針刺方法:選用30號1寸一次性無菌針灸針，分別從頂骨中點向耳根前與頭皮呈15°夾角透刺0.5～0.8寸，快速捻轉至針下沉澀感后，同側頭穴為一對，接LH202H型韓氏穴位神經刺激儀，采用疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，強度1 mA，每次持續刺激30 min。頭針IR12組的治療在大鼠手術蘇醒后12 h進行，以后的治療每隔24 h進行1次，并于取材前2 h行最后1次治療。正常對照組、假手術組和模型組按治療時間同樣抓取，不進行任何治療。連續觀察10 d，詳細觀測、記錄各組大鼠的一般情況、體質量和血壓。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 HE染色法觀察缺血局部腦皮質病理形態變化 大鼠灌注后迅速取腦，剝離腦膜除去嗅球、延髓和小腦，在視交叉平面前后2 mm處將腦冠狀切開，所取組織置于固定液中進行脫水、包埋、切片，用二甲苯和無水乙醇進行切片脫蠟，放入Harris蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗;再入伊紅染液中染色1～3 min;將切片依次放入95%酒精I 5 min－95%酒精II 5 min－無水乙醇Ⅰ5 min－無水乙醇Ⅱ5 min－二甲苯Ⅰ5 min－二甲苯Ⅱ5 min中脫水至透明后晾干，中性樹膠封片。

1.6.2 IL-6含量測定 采用酶聯免疫吸附法檢測，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.6.3 P-JAK2、P-STAT5蛋白含量測定 頸椎脫臼法處死大鼠，冰上剝取腦皮質充分勻漿(在碎冰塊中進行)，振蕩并冰浴30 min，12000 g離心5 min，收集上清為總白蛋白液，－80℃保存備用;采用Bradford方法測定蛋白濃度，在40 μg蛋白標本中加入適當體積的5×蛋白上樣緩沖液，95～100℃處理5 min;根據蛋白質20KD相對分子量選用對應濃度的分離膠，按濃縮膠75 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，至溴酚藍剛出膠;以200 mA/h為條件進行轉膜;脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)封閉30 min;用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋一抗，4℃過夜;室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min;將辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體，用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min;用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，最后進行顯影和定影，Alpha軟件處理系統分析目標帶的吸光度值。以β-actin為內參，計算 P-JAK2/β-actin、P-STAT5/ β-actin吸光度比值，反映P-JAK2和P-STAT5相對含量變化。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間腦皮質病理形態

HE染色后光鏡下觀察發現，正常組和假手術組大鼠腦皮質形態正常，染色均勻，組織結構清晰致密，細胞質淡紅色，胞核藍染，輪廓清楚;假手術組僅見極少量炎性細胞。造模后大鼠局部腦皮質可見神經細胞減少，胞漿疏松，胞體縮小、變形，染色變淺;間質水腫，炎性細胞增多，微血管內皮水腫明顯甚至脫落，管腔變形;微血管周圍間隙增寬，周圍結構不清。頭針治療后，其組織結構紊亂及間質水腫明顯減輕。

2.2 大鼠腦皮質IL-6含量比較

表1顯示，假手術組IL-6含量與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05);造模后IL-6明顯增多，除IR 24 h外，頭針組IL-6含量均少于模型組(P＜0.05)，特別是在IR 48 h時差異最明顯(P＜0.01)。

表1 各組大鼠腦皮質IL-6含量比較(±s，pg/mg)

表1 各組大鼠腦皮質IL-6含量比較(±s，pg/mg)

注:與同時間正常對照組比較:△△P＜0.01;與同時間模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

12 h 24 h 48 h 72 h正常對照組組別 例數10 2.87±0.63 2.87±0.63 2.87±0.63 2.87±0.63假 手 術 組 10 2.92±1.01 2.92±1.01 2.92±1.01 2.92±1.01模 型 組 40 8.92±0.39△△ 10.57±0.68△△ 12.39±0.54△△ 11.83±0.83△△頭 針 組 40 7.59±0.92△△# 10.21±0.71△△ 10.77±1.14△△## 10.01±0.76△△#

2.3 大鼠腦皮質P-JAK2蛋白含量比較

表2和圖1顯示，假手術組P-JAK2蛋白含量與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05);IR 12 h和IR 72 h頭針組P-JAK2蛋白含量較模型組多(P＜0.05)，而IR 24 h和48 h電針組P-JAK2蛋白含量與同時間模型組比較，2組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腦皮質P-JAK2蛋白含量比較(±s)

表2 各組大鼠腦皮質P-JAK2蛋白含量比較(±s)

注:與同時間正常對照組比較:△△P＜0.01;與同時間模型組比較:#P＜0.05

組別 例數12 h 24 h 48 h 72 h正常對照組10 0.30±0.38 0.30±0.38 0.30±0.38 0.30±0.38假 手 術 組 10 0.34±0.59 0.34±0.59 0.34±0.59 0.34±0.59模 型 組 40 0.85±0.09△△ 1.40±0.07△△ 2.04±0.12△△ 1.27±0.52△△頭 針 組 40 1.09±0.34△△# 1.38±0.61△△ 1.92±0.29△△ 1.59±1.09△△#

圖1 各組大鼠腦皮質P-JAK2蛋白電泳檢測結果

2.4 大鼠腦皮質P-STAT5蛋白含量比較

假手術組P-STAT5蛋白含量與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05);不同缺血再灌注時間電針組比模型組P-STAT5蛋白含量表達均多，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表3 各組大鼠腦皮質P-STAT5蛋白含量比較(±s)

表3 各組大鼠腦皮質P-STAT5蛋白含量比較(±s)

注:與同時間正常對照組比較:△△P＜0.01;與同時間模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組別 例數12 h 24 h 48 h 72 h正 常對照 組10 0.10±0.38 0.10±0.38 0.10±0.38 0.10±0.38假 手 術 組 10 0.09±0.59 0.09±0.59 0.09±0.59 0.09±0.59模 型 組 40 0.29±2.21△△ 0.57±1.57△△ 0.86±0.92△△ 0.70±3.43△△頭 針 組 40 0.69±1.54△△# 1.12±1.16△△## 1.47±2.59△△## 1.25±1.05△△##

圖2 各組大鼠腦皮質P-STAT5蛋白電泳檢測結果

3 討論

頭針是一種臨床治療腦血管病常見、簡便、有效的中醫外治方法，起源于《黃帝內經》。《靈樞·五亂》明確記載:“亂于頭，則為厥逆，頭重眩仆……氣在于頭者，取之天柱大杼。”頭為諸陽之會，氣血聚集之要，“病變在腦、首選督脈”為歷代醫家的共識［5-6］。本實驗選用的頭針刺“頂顳前斜線、頂顳后斜線”主要治療中樞性肢體癱和肢體感覺障礙，為改善中風后神經行為學障礙的首選［7］，在改善腦電活動、縮小梗死體積、抑制神經元凋亡等方面療效獨特［8-9］。

中風導致神經元壞死并產生局部腦組織的炎癥反應，IL-6作為一種多功能單鏈糖蛋白細胞因子，其表達水平的高低是反映缺血再灌注炎癥損傷的重要指標［10-11］。在本實驗中隨著缺血再灌注時間的延長，IL-6的含量相應增加，與以往結論相似。但細胞因子的這一炎癥效應可以向有益的方向轉變，取決于其在腦組織中的濃度、缺血再灌注時間和非常復雜的細胞內信號網絡的激活［12］。通過病理形態學觀察發現，IR 12 h和IR 24 h腦皮質損傷的速度雖快，但基本形態還算完整，但到后期隨著IL-6含量的不斷增加，局部神經元變形壞死、微血管內皮脫落、胞質疏松、水腫明顯，頭針干預后能明顯降低皮質中IL-6的表達速度，以減輕炎癥反應的程度。另一方面，缺血后JAK2在局部組織的異常激活和過度表達會增加炎癥反應［12］。本研究也發現，造模后隨著時間的延長，腦皮質中P-JAK2含量不斷上升，特別是在IR 48 h表達最多，此時IL-6的含量也最高，組織結構損傷最嚴重;對MCAO大鼠給予頭針治療后，雖然在IR 72 h P-JAK2蛋白含量較同時間模型組的含量多，但高濃度的P-JAK2并沒有引起進一步腦損傷，反而受損的神經元和微血管開始修復。這可能與頭針的作用有關，說明頭針干預IL-6的分泌可能是通過調控P-JAK2表達來實現的，因為JAK2能激活IL-2、IL-6、EPO、INF-γ等相關炎癥因子受體［14］。

早在2006年，有學者［15］就檢測到JAK蛋白在SD大鼠腦內有廣泛表達，并與STAT協同作用來影響腦缺血后神經元的凋亡;JAK2的磷酸化可激活下游分子 STAT5，提高缺血區神經元耐缺氧能力［16-17］。通過對P-STAT5蛋白印跡檢測發現，急性腦缺血后局部腦皮質P-STAT5蛋白含量在IR 12 h就開始增加，48 h表達到峰值，且 P-JAK2與 PSTAT5的表達水平保持一致。雖然IR 24 h和IR 48 h頭針組P-JAK2減少，但在IR12 h和72 h頭針對P-JAK2蛋白表達又有促進作用;且頭針組P-STAT5蛋白含量一直多于模型組，進一步說明頭針對MCAO大鼠局部腦皮質中的JAK2/STAT5信號通路的激活有促進作用。

綜上所述，頭針能有效激活急性腦缺血再灌注后局部腦皮質中JAK2/STAT5分子信號通路，促進該通路中JAK2、STAT5蛋白分子的磷酸化。在缺血再灌注早期，頭針可能通過降低P-JAK2含量以調控IL-6的表達來減輕局部皮質的炎癥反應;在缺血再灌注中后期，可能通過增加P-JAK2蛋白含量促進其下游P-STAT5蛋白表達，以改善受損腦皮質的病理形態。但急性腦缺血后血流再灌注引起的炎癥反應涉及多個分子信號傳導通路，因此頭針治療的作用機制仍需進一步的研究和探討。

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:1006-3250(2016)08-1084-04

2016-01-04

海南省自然科學基金資助項目(20158371)-不同時間頭針對MCAO大鼠缺血局部腦皮質微血管新生的影響研究

梁 超(1984-)，女，湖北武漢人，主治醫師，醫學博士，從事針灸治療神經系統疾病的臨床與實驗研究。

△通訊作者:姜 濤(1982-)，男，遼寧沈陽人，主治醫師，醫學學士，從事針灸治療神經系統疾病的臨床與研究，Tel: 15348880418，E-mail:17664226@qq.com。