新型溫度敏感水凝膠作為動脈瘤栓塞材料的初步研究

何亮，甄勇，張恒柱 ，宋炳偉 ，嚴(yán)正村，羅祺

(1.江蘇省蘇北人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，江蘇 揚州　225001; 2.吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春　130021)

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新型溫度敏感水凝膠作為動脈瘤栓塞材料的初步研究

何亮1，甄勇1，張恒柱1，宋炳偉1，嚴(yán)正村1，羅祺2

(1.江蘇省蘇北人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，江蘇 揚州225001; 2.吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130021)

[摘要]目的:探討微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠作為一種新型動脈瘤栓塞材料的可行性。方法:將殼聚糖/甘油磷酸鈉溶液(1∶7)與海藻酸鈉微球按不同比例混合，超聲乳化、冰浴攪拌后，制成微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠，檢測其pH值、成膠時間和力學(xué)強度，選擇最佳配比；通過體外動脈瘤模型栓塞實驗評價其導(dǎo)管內(nèi)操控性和瘤內(nèi)成膠性，通過兔耳中動脈栓塞實驗評價其組織相容性。結(jié)果:當(dāng)殼聚糖/甘油磷酸鈉溶液與海藻酸鈉微球體積比為1∶2時，所得水凝膠的pH值為7.28，成膠時間約2.5 min，最大應(yīng)力在壓縮應(yīng)變?yōu)?0%時已達到14 kPa，峰值可達25 kPa。體外動脈瘤模型栓塞過程中未出現(xiàn)溢膠現(xiàn)象，拔除微導(dǎo)管時亦未見有黏管或拉絲現(xiàn)象。兔耳中動脈栓塞后未出現(xiàn)組織排異反應(yīng)；3 d后血管壁見少量炎癥細(xì)胞浸潤，1周時炎癥反應(yīng)達到高峰，3周后血管壁炎癥細(xì)胞明顯減少。結(jié)論:初步證實微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠是一種新型非黏附性組織工程材料，具有合適的pH值和成膠時間，良好的力學(xué)強度、操控性、瘤內(nèi)成膠性和組織相容性，可用于動脈瘤栓塞。

[關(guān)鍵詞]微球； 殼聚糖； 甘油磷酸鹽； 水凝膠； 動脈瘤； 栓塞材料

顱內(nèi)動脈瘤是腦動脈壁的異常膨出，可引起自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦內(nèi)血腫，若治療不當(dāng)，致殘病死率很高。目前治療顱內(nèi)動脈瘤的方法主要有開顱夾閉術(shù)和介入栓塞術(shù)，隨著近年來栓塞材料的發(fā)展和介入技術(shù)的進步，血管內(nèi)介入治療已成為顱內(nèi)動脈瘤治療的首選方案[1]。但是，如何降低動脈瘤的再通率、減小復(fù)發(fā)風(fēng)險，一直是困擾介入治療的難題[2- 3]。利用組織工程材料促進動脈瘤頸部內(nèi)皮細(xì)胞增生，達到動脈瘤的解剖學(xué)治愈，可能是解決這一難題的途徑之一。本研究利用殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠的溫度敏感性，加入不同比例的海藻酸鈉微球，形成微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠，檢測不同配比混合物的理化性質(zhì)，并行體外動脈瘤模型栓塞和體內(nèi)動脈栓塞實驗，以期找到一種配比合適、可用于動脈瘤治療的新型栓塞材料，為進一步研究創(chuàng)造條件。

1材料與方法

1.1材料

海藻酸鈉微球(中科院長春應(yīng)用化學(xué)研究所高分子物理與化學(xué)國家重點實驗室，直徑10~200 μm)、殼聚糖(沈陽國藥集團，脫乙酰度90%)、甘油磷酸鈉(瑞士Fluka公司)、Instron- 5869型材料試驗機(美國Instron公司)、玻璃管動脈瘤模型(自制，大小約5 mm×4 mm)、中國大耳白兔(揚州大學(xué)動物實驗中心提供，共6只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg)。

1.2方法

1.2.1新型溫度敏感水凝膠的制備根據(jù)前期實驗結(jié)果[4- 5]，制成殼聚糖/甘油磷酸鈉體積比為1∶7的溶液(C- GP溶液)，將海藻酸鈉微球按不同比例加入其中，超聲乳化使其分散均勻，進行冰浴攪拌30 min后放入37 ℃水浴中形成凝膠。

1.2.2理化性能測試測定上面制備的不同配比水凝膠的pH值，用試管倒置法在37 ℃下觀察其凝固時間，制成直徑20 mm、高度15 mm的圓柱體，置于Instron- 5869型材料試驗機下，測定其力學(xué)強度，測量3次，取平均值。

1.2.3體外動脈瘤模型栓塞在37 ℃靜水水浴狀態(tài)下，往微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠中加入適量顯影劑鉭粉，將微導(dǎo)管(echelon- 14)置入自制的玻璃管動脈瘤模型內(nèi)，充盈保護球囊(Hyperglide)后緩慢推注水凝膠約0.2 ml，觀察其操控性和瘤內(nèi)成膠性。

1.2.4兔耳中動脈栓塞取中國大耳白兔6只，全麻成功后用手指壓迫兔耳中動脈近端阻斷血流，將0.2 ml 微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠緩緩注入雙側(cè)兔耳中動脈，待凝膠成形后松開手指觀察局部血運情況，并于術(shù)后3天、1周、3周時各取2只制作兔耳中動脈病理切片，HE染色，觀察水凝膠的組織相容性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠理化性能測試結(jié)果

體積比為1∶7的殼聚糖/甘油磷酸鈉溶液中加入不同比例的海藻酸鈉微球后，隨著微球含量的增加，混合物pH值呈十分平緩下降趨勢(圖1)。C- GP溶液與微球混合體積在1∶1~1∶4之間時，其對應(yīng)的pH值波動于7.30~7.25之間，符合人體生理條件。試管倒置法在37 ℃下測得凝固時間隨微球含量的增多而縮短(圖2)，當(dāng)C- GP溶液與微球混合體積比為1∶2時，凝固時間約2.5 min，符合導(dǎo)管操作體內(nèi)快速成膠的時間要求，且較單純C- GP溶液成膠時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將凝固成膠后的圓柱體，置于Instron- 5869型材料試驗機下測定力學(xué)強度，隨壓縮應(yīng)變的增大，最大應(yīng)力先迅速增大后逐漸減小(圖3)：當(dāng)壓縮應(yīng)變達20%時，最大應(yīng)力已達到14 kPa，可承受血流沖擊；壓縮應(yīng)變達30%時，最大應(yīng)力達到峰值，為25 kPa；之后，壓縮應(yīng)變進一步增大，最大應(yīng)力緩慢減小，壓縮應(yīng)變達50%時，最大應(yīng)力仍有16 kPa。

圖1不同比例C- GP溶液與微球混合物pH值

圖2不同比例C- GP溶液與微球混合物成膠時間(37 ℃)

圖3微球- 聚殼糖/甘油磷酸鈉復(fù)合物力學(xué)強度

2.2微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠體外動脈瘤模型栓塞實驗結(jié)果

將C- GP溶液與微球體積比為1∶2的水凝膠經(jīng)微導(dǎo)管緩慢推注至體外玻璃管動脈瘤模型內(nèi)，約0.2 ml可完全充盈動脈瘤腔，水凝膠開始為半透明的淡黃色黏滯液體，聚集成團并逐漸凝固后成為乳白色凝膠(圖4)；加入適量鉭粉后，水凝膠具有X線可視性，可用于介入術(shù)中操控(圖5)。拔除微導(dǎo)管時，未見有黏管或拉絲現(xiàn)象。

圖437 ℃水浴下通過微導(dǎo)管在體外玻璃管動脈瘤模型內(nèi)成膠

圖5水凝膠加入鉭粉后體外動脈瘤栓塞實驗

2.3微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠兔耳中動脈栓塞實驗結(jié)果

兔耳中動脈內(nèi)緩緩注入微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠后，約2.5 min形成固態(tài)凝膠，松開壓迫的手指，見局部動脈蒼白、纖細(xì)，遠端血管搏動消失，阻塞完全(圖6)。栓塞后3 d，病理觀察顯示凝膠形態(tài)均勻，與血管分界清楚，管壁見少量炎癥細(xì)胞浸潤(圖7)；1周時炎癥反應(yīng)達到高峰；3周后凝膠內(nèi)有少量內(nèi)皮細(xì)胞生長，與血管分界欠清，管壁內(nèi)炎癥細(xì)胞減少(圖8)。

3討論

目前治療動脈瘤的最佳策略是利用組織工程材料，促進動脈瘤頸部組織增生，重建血管壁，從而達到動脈瘤的解剖學(xué)治愈，降低復(fù)發(fā)率[6- 7]。為達到此目標(biāo)，開發(fā)一種既能達到致密栓塞，又能有助于動脈瘤頸部組織修復(fù)的液體栓塞材料十分關(guān)鍵。

圖6水凝膠栓塞兔耳中動脈后局部動脈蒼白，遠端血管搏動消失

圖7兔耳中動脈栓塞3 d后凝膠形態(tài)均勻，與血管分界清楚，管壁見少量炎癥細(xì)胞浸潤(HE ×200)

圖8兔耳中動脈栓塞3周后凝膠內(nèi)有少量內(nèi)皮細(xì)胞生長，與血管分界欠清，管壁內(nèi)炎癥細(xì)胞減少(HE ×100)

殼聚糖(chitosan)是一種天然高分子材料，由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用而得到的，化學(xué)名為聚葡萄糖胺(1- 4)- 2- 氨基- B- D葡萄糖，具有良好的生物相容性、可降解性和安全性，在醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛用于止血、抗菌、調(diào)節(jié)免疫活性、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、透析膜、人造骨和皮膚、藥物載體等方面。殼聚糖只在酸性環(huán)境下保持溶液狀態(tài)，pH值大于6.2時，其溶液開始出現(xiàn)沉淀[8]，但Chenite等[9]發(fā)現(xiàn)，加入弱堿性的甘油磷酸鈉后，該系統(tǒng)可在室溫下中性環(huán)境中保持液體狀態(tài)，而在37 ℃時形成凝膠，此過程中無熱量或其他物質(zhì)產(chǎn)生，故可以加載細(xì)胞或其他大分子物質(zhì)。同時，通過調(diào)整混合物中不同成分的配比，可以控制成膠時間。筆者所在團隊前期的實驗[4- 5]表明，隨著甘油磷酸鈉含量的增加，殼聚糖/甘油磷酸鈉溶液凝膠時間縮短，當(dāng)兩者體積比為1∶7時，pH值為7.3，成膠時間約3.5 min，為較理想的配比；但此材料亦存在不足，如機械強度較低，當(dāng)壓縮應(yīng)變達到40%時，最大應(yīng)力才達到可承受血流沖擊的14 kPa。

為改良?xì)ぞ厶?甘油磷酸鈉溶液的理化特性，使其更適于動脈瘤的栓塞治療，本研究在原有溶液中加入不同比例的海藻酸鈉微球，制成微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有良好的穩(wěn)定性、溶解性、貼附性、黏性和安全性，有濃縮溶液、形成凝膠和成膜能力[10]。將海藻酸鈉微球引入殼聚糖/甘油磷酸鈉體系后，原有溶液的pH值稍有降低，但變化幅度很小(P>0.05)，仍處于人體生理范圍內(nèi)；成膠時間較原溶液明顯縮短(P<0.05)，且隨著微球含量的增加成膠速度進一步加快，當(dāng)C- GP與微球體積比達1∶2時，約2.5 min即可成膠，符合導(dǎo)管操作體內(nèi)快速成膠的時間要求。改良后的微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠，其機械強度較單純C- GP溶液明顯增強，壓縮應(yīng)變達20%時，最大應(yīng)力已達到14 kPa，可承受血流沖擊；最大應(yīng)力峰值可達25 kPa，完全可以承受運動、咳嗽、高血壓病等引起的血流變化，使栓塞后的動脈瘤更加穩(wěn)定，復(fù)發(fā)率進一步降低。

在體外玻璃管動脈瘤模型栓塞實驗中，保護球囊的應(yīng)用，可臨時封堵瘤頸口、阻斷管內(nèi)水流，使微導(dǎo)管內(nèi)推注水凝膠時易于控制出膠的方向和速度，盡可能達到一次完全栓塞，并防止出現(xiàn)水凝膠的外溢造成異位栓塞；同時，新型水凝膠成膠迅速，2.5 min即形成固態(tài)凝膠，在組織缺血缺氧耐受時間窗內(nèi)，符合臨床操作的要求。體外動脈瘤栓塞實驗證實微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠具有良好的原位成膠性，可達到一次完全栓塞，且栓塞過程中未出現(xiàn)溢膠現(xiàn)象，拔除微導(dǎo)管時亦未見有黏管或拉絲現(xiàn)象，非常適合介入操作。

在體內(nèi)兔耳中動脈栓塞實驗中，病理結(jié)果顯示微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠具有良好的組織相容性，栓塞后未出現(xiàn)明顯排異反應(yīng)。固態(tài)凝膠起初形態(tài)均勻，與血管分界清楚，3周后部分凝膠降解，凝膠內(nèi)有內(nèi)皮細(xì)胞生長，符合最終通過血管內(nèi)皮細(xì)胞生長封閉動脈瘤、達到解剖學(xué)治愈的要求。另外，動脈栓塞實驗亦提示微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠具有一定的致炎性，但炎癥反應(yīng)程度輕，血管壁僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤，且炎癥反應(yīng)時間較短，3周后血管壁內(nèi)炎癥細(xì)胞已較前明顯減少。有文獻報道，局部炎癥反應(yīng)與殼聚糖的脫乙酰度呈負(fù)相關(guān)[11]，即脫乙酰度越高，炎癥反應(yīng)程度越輕、持續(xù)時間越短。

本研究通過在殼聚糖/甘油磷酸鈉溶液中加入不同比例的海藻酸鈉微球，制成微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠，檢測其pH值、成膠時間和力學(xué)強度，找到最佳配比，并在體外動脈瘤模型中觀察其操控性和瘤內(nèi)成膠性，在體內(nèi)兔耳中動脈栓塞實驗中觀察其組織相容性，初步驗證了此材料用于動脈瘤栓塞治療的可行性。與原有溫度敏感水凝膠相比，微球- 殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠具有成膠更快、機械強度更大的特點，而pH值變化不大，仍處于人體生理范圍內(nèi)，且操控性、瘤內(nèi)成膠性、組織相容性良好，炎癥反應(yīng)輕，是一種新型動脈瘤栓塞材料，為下一步組織工程治療動脈瘤創(chuàng)造了條件。

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The study of microspheres- chitosan/glycerophosphate hydrogel as the embolism meterial of aneurysms

HE Liang1，ZHEN Yong1，ZHANG Heng- zhu1，SONG Bing- wei1，YAN Zheng- cun1，LUO Qi2

(1.DepartmentofNeurosurgery，SubeiPeople’sHospitalofJiangsuProvince，Yangzhou225001，China;2.DepartmentofNeurosurgery，theFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

[Abstract]Objective: To evaluate the feasibility of the injectable thermosetting microspheres- chitosan/glycerophosphate(M- C/GP) hydrogel as a new embolism meterial of aneurysms. Methods: Chitosan/glycerophosphate solution(1∶7) and sodium alginate microspheres were mixed in different volume ratios. The hydrogel of microspheres- chitosan/glycerophosphate(M- C/GP) was prepared by ultrasonic emulsification and ice bath stirring. The pH，colloidization time and mechanic strength of the hydrogel were detected respectively to determine the best ratio. The intracatheter manipulation and intratumoral gelation of the M- C/GP hydrogel was evaluated by embolizing aneurysm models. The tissue compatibility of the M- C/GP hydrogel was evaluated by embolizing rabbit ear arteries. Results: When the ratio of M- C/GP was 1∶2 at pH 7.28，the colloidization time was 2.5 minutes and the mechanic strength could reach 14 kPa at the compression strain of 20%，with the peak of 25 kPa. In the experiment of embolizing aneurysm models in vitro，the phenomenon of M- C/GP overflow was not observed during the embolizing，nor the phenomenon of M- C/GP colloghore during the drawing microcatheter. In the experiment of embolizing rabbit ear arteries in vivo，tissue rejection was not happened. A few of inflammatory cells were found in the vessel walls 3 days after embolizing rabbit ear arteries. The number of inflammatory cells was gradually increased in the peak in 1 week，and significantly reduced in 3 weeks. Conclusion: Preliminarily，M- C/GP can be a kind of new non- adhesion tissue engineering materials，with suitable pH，right colloidization time，better mechanical strength，intracatheter manipulation，intratumoral gelation and tissue compatibility，which can be used to embolize aneurysms．

[Key words]microspheres; chitosan; glycerophosphate; hydrogel； aneurysms； embolism materials

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．014

[中圖分類號]R651.12

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0063- 05

[通信作者]甄勇E- mail:panyu75@163.com

[作者簡介]何亮(1982-)，男，江蘇揚州人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。 E- mail:yzheliang@163.com

[基金項目]蘇北人民醫(yī)院院級基金資助項目(yzucms201323)

[收稿日期]2015- 06- 24[修回日期] 2015- 11- 14

[引文格式] 何亮，甄勇，張恒柱，等.新型溫度敏感水凝膠作為動脈瘤栓塞材料的初步研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：63- 67.

·論著·