點陣激光干預黃褐斑小鼠模型c—kit表達的研究

李波 譚軍 鐘茜 李高峰 吳維子

[摘要]目的：檢測點陣激光治療前后黃褐斑實驗動物皮損中c-kit的變化，探討點陣激光對黃褐斑的治療機理。方法：建立黃褐斑實驗動物模型，應用點陣激光干預動物模型。應用免疫組化染色方法檢測治療前后c-kit表達的變化，使用醫學圖像定量分析系統定量檢測各標本中c-kit的陽性染色指數（pos it ive

index，PI）。結果：c-kit在黃褐斑小鼠模型中呈強陽性表達，點陣激光干預側c-kit表達明顯低于未干預側，P<0.05。結論：點陣激光可能通過減少或抑制c-kit表達從而達到治療黃褐斑的目的。

[關鍵詞]點陣激光；黃褐斑；小鼠模型；C-kit

[中圖分類號]R758.4+2

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）02-0030-03

黃褐斑是發生在顏而部的色素沉著斑，多發生于女性，皮損對稱性分布于顏而、額、而頰、鼻背、唇周及頦部皮膚；形態不規則，呈淡褐色或暗褐色，邊界明顯或模糊不清，常呈大片狀分布。其病因復雜，目前并不完全清楚，現認為是多種因素綜合的結果。其主要因素有：過度接觸紫外線，內分泌失調，情緒情感因素，遺傳等。該疾病也是美容皮膚科治療的重點和難點之一。目前點陣激光是皮膚美容醫學研究的熱點，有學者應用點陣激光治療黃褐斑取得了良好的療效，但也有學者質疑其效果，同時對于點陣激光治療黃褐斑的機制并不清楚。近來，有研究顯示c-kit與黑素合成關系密切，并發現c-kit在許多色素性疾病中表達明顯增高，通過與其配體干細胞因子（stem cell factor，SCF）的結合，使黑素細胞內酪氨酸酶的表達增加、活性增強，黑素合成增加。

筆者應用雌激素與UVB聯合刺激白色小鼠建立黃褐斑動物模型，并應用點陣激光干預，檢測治療后c-kit表達的變化并與未干預組對比，以期了解點陣激光治療對病損皮膚c-kit表達的影響。

1 資料和方法

1.1 動物模型制作、取材與干預

選取健康成年雌性白色小鼠25只，通過對實驗小鼠進行紫外線背部特定部位祛毛后照射、注射黃體酮和慢性應激抑郁刺激法綜合作用建立小鼠黃褐斑實驗動物模型，其中5只對照背部左右側造模前后均取材。其余20只以低能量點陣CO²激光治療左側皮損區，取對側作為對照，激光干預后背部兩側每日外用四環素油膏lOd，4次/d，術后3周殺死所有小鼠，取背部皮損區標本。

1.2 設備與參數

美國科醫人公司生產Encore ActiveFX^TM CO²點陣激光設備，參數：30mJ/c㎡，40HZ，1-3-3，CPG模式。

1.3 免疫組織化學染色觀察

所有標本經福爾馬林固定、脫水、包埋后，4μm厚石蠟切片，60℃烤片4-8h，石蠟切片脫蠟至水，加入0.Olmmol/l pH6.O檸檬酸緩沖液，微波處理lOmin，2次；蒸餾水洗，浸入PBS液中5min，3%H₂O₂阻斷內源性過氧化物酶活性。每張切片加入兔抗鼠單克隆c-kit抗體，1：100稀釋，4℃孵育過夜，PBS沖洗，5mln 3次，加入PV-6000通用型免疫組化二步法檢測試劑盒，37℃孵育20min，PBS沖洗，5min 3次，然后將切片置于AEC顯色液中顯色20min；蒸餾水沖洗，蘇木素復染5s，水溶性封片劑封片。應用PBS替代兔抗鼠c-kit抗體作陰性對照。

按照曹芳等的方法：采用MioAS醫學圖像定量分析系統對免疫組織化學切片行定量分析。c-kit陽性產物位于胞漿內呈現黃色、棕黃色、棕褐色顆粒均為陽性表達。MioAS在光鏡400倍，電壓3.66V、電流2.27A條件下，每張切片隨機選取3個高倍視野，每個視野必須包括表皮全層與部分真皮，并將胞漿內或ECM出現淡黃色顆粒時界定為陽性染色強度（optical，density，OD）為1，此為OD低限，當出現棕黃色、棕褐色等染色顆粒時，計算機以OD為1時的染色強度為參照，測量出相應的OD值。同時將每個高倍視野而積劃分為35.1萬個像素點，1個像素點=0.039μ㎡，陽性染色而積（positive area，PA）以像素點表示。計算免疫組織化學陽性染色指數（positive index，PI），PI=PA×OD，每組示蹤結果重復3次，取PI平均值作為c-kit的相對含量。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗，P

2 結果

從切片與檢測結果來看c-kit在未造模的正常白色小鼠上皮中表達較少，在大部分黃褐斑小鼠模型上皮中呈強陽性表達（圖1）。點陣激光干預后，干預側較未干預側PI值明顯降低，表示c-kit表達明顯降低，PO.05。

3 討論

黃褐斑是皮膚美容醫學的難題，是多因素作用的結果，既往學者應用注射黃體酮或紫外線照射等方式來造模，這些造模方法只是單一的反應黃褐斑疾病的一種狀態，近來已有學者開始應用多種干擾因素開始造模并獲得成功，筆者應用此種因素制作黃褐斑模型較能正確反映黃褐斑的病理生理狀態。

2004年Imokawa等提出皮膚黑色素細胞、角質形成細胞、成纖維細胞等能產生多種細胞因子并構成網絡，互相協調，共同調節黑素顆粒的合成、成熟及轉運等。干細胞因子（SCF）和其配體c-kit就是一對重要的細胞因子。SCF發揮作用需依賴于特定的配體（c-kit）形成配基受體二聚體復合物，從而啟動相應的信號傳導通路，調控細胞的各種生物學行為。c-kit作為III型跨膜蛋白酪氨酸激酶受體蛋白家族成員之一，已發現其在黑色素生成、造血、肥大細胞發育及功能等方面均發揮著重要的作用。皮膚中SCF和c-kit主要由角質形成細胞與成纖維細胞分泌，SCF與其配體c-kit結合后，后者能迅速催化自身磷酸化，促進配基受體二聚物的形成，并磷酸化胞漿內信號分子，依次激活酪氨酸激酶、酪氨酸酶，轉化酪氨酸為黑色素。

研究證實SCF/KIT途徑在維持黑色素細胞的存活、誘導遷移、調節黑色素細胞的增殖與黑色顆粒的合成中起了極為關鍵的作用。Kang等認為：黃褐斑病損皮膚組織中SCF（干細胞因子）和其配體c-kit的高表達是導致色素沉著的重要因素。李菲等在比較了黃褐斑、黑變病和炎癥后色素沉著皮損中c-kit受體的表達后，發現黃褐斑中c-kit受體的表達較另兩組顯著增高，并認為c-kit受體可能在黃褐斑的色素沉著中起著重要的調控作用。

隨著點陣激光應用的擴展，許多學者應用其治療黃褐斑取得了良好的療效。2005年Tannous報道應用1550nm點陣激光治療多種治療抵抗的混合型黃褐斑患者，治療了2次，間隔3周，在隨后的6個月隨訪中，見色素明顯減退，而且無明顯副作用。爾后，又不斷有學者報道應用點陣激光治療黃褐斑患者獲得了較好的療效。為進一步證實點陣激光的治療效果，Goldberg等在治療前及治療后3個月取活檢，光鏡顯示治療后組織內色素細胞數量相對降低，電鏡顯示在角質形成細胞周圍色素細胞數量減少及黑素顆粒相對減少，Goldberg認為可能與點陣激光改變組織的超微結構有關。其具體機制尚待研究。

激光治療皮膚色素疾病時，高流量能直接汽化和剝脫病損組織，且治療深度深，可能刺激皮膚色素細胞，導致明顯的皮膚色素沉著反應，使色斑加深。激光在能量較低時有其光化學效應或生物學效應，對組織細胞產生一定影響。點陣激光以其特有的隨機點狀治療模式，可以最大限度的減少激光光斑對周圍組織熱損傷，且治療部位保留部分原有組織，“橋”狀愈合模式縮短了治療后恢復時間。有學者應用點陣激光高能量剝脫治療黃褐斑后，其即時效果明顯，但在治療后3-6周，所有病例均出現暫時性炎癥后色素沉著，同時部分病例伴發持久性紅斑，提示點陣激光治療黃褐斑的流量需要控制，避免出現明顯剝脫效果。同時研究采用的為白色雌性小鼠，皮膚較人類薄，故本研究應用的點陣CO₂激光流量為30mJ/c㎡，較低能量治療，應用CPG（電腦圖形生成系統）模式，點狀散在治療，中間保留部分原有組織，能有效縮短愈合時間。

筆者觀察到點陣CO₂激光治療后皮損中c-kit表達明顯降低，未干預組皮損中c-kit降低緩慢，兩者相比有統計學意義；同時治療后的黃褐斑模型比未治療的色素減輕，提示點陣CO₂激光在可能通過某一途徑減少或抑制c-kit表達，達到治療黃褐斑的目的，其具體機制仍須進一步研究。