中國(guó)地鼠口腔頰囊黏膜癌模型的建立及癌變的動(dòng)態(tài)觀察

皇甫冰，龐文彪，張銳虎，郭　 民，高繼萍，宋國(guó)華*（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001）

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中國(guó)地鼠口腔頰囊黏膜癌模型的建立及癌變的動(dòng)態(tài)觀察

皇甫冰，龐文彪，張銳虎，郭 民，高繼萍，宋國(guó)華*
（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001）

【摘要】目的： 利用二甲基苯并蒽(DMBA)涂抹法建立中國(guó)地鼠頰囊黏膜癌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察癌變不同時(shí)期的組織學(xué)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。方法：將60只雄性中國(guó)地鼠隨機(jī)分為3組，分別為模型組(24只)、溶劑對(duì)照組(12只)、空白對(duì)照組(24只)。溶劑對(duì)照組僅涂丙酮液，空白對(duì)照組不作任何處理，模型組以0.5% DMBA涂抹中國(guó)地鼠兩側(cè)頰囊，每周3次，共15周。分別于第6、9、12、15周將模型組和空白對(duì)照組隨機(jī)處死6只，溶劑對(duì)照組處死3只，在肉眼及光鏡下動(dòng)態(tài)觀察頰囊黏膜癌變?nèi)^(guò)程的形態(tài)學(xué)和顯微組織學(xué)改變。結(jié)果：與對(duì)照組比較，DMBA長(zhǎng)時(shí)間處理后模型組地鼠相繼出現(xiàn)口腔內(nèi)黏膜充血、增厚、潰爛化膿、白斑及菜花狀贅生物等變化，經(jīng)歷了單純上皮增生(6~9周)、不同程度上皮異常增生(9~12周)、原位癌及鱗狀細(xì)胞癌(12~15周)等階段。結(jié)論：DMBA涂抹法可成功建立中國(guó)地鼠頰囊黏膜癌前病變、鱗狀細(xì)胞癌模型，發(fā)病過(guò)程與人類口腔鱗狀細(xì)胞癌相似，為口腔鱗癌的多階段、多步驟研究提供了一個(gè)較為理想的動(dòng)物模型。

【關(guān)鍵詞】中國(guó)地鼠；頰囊黏膜；口腔鱗狀細(xì)胞癌；二甲基苯并蒽；動(dòng)物模型

作者信息： 皇甫冰，E-mail：bhuangfu@hotmail.com。*通信作者，宋國(guó)華，E-mail：ghsongg@hotmail.com

Development of oral buccal pouch mucosa cancer in Chinese hamsters and dynamic observation of their carcinogenesis

HUANGFU Bing，PANG Wenbiao，ZHANG Ruihu，GUO Min，GAO Jiping，SONG Guohua*
(Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE：To observe the dynamic histological changes in dimethylbenzanthracene(DMBA)-induced cancer in the Chinese hamster’s buccal pouch mucosa cancer experimental animal model. METHODS： 60 male Chinese hamsters were randomly divided into three groups：experimental group(24 hamsters)，solvent control group (12 hamsters) and control group(24 hamsters). In the solvent control group，the site was only coated with acetone solution. The buccal pouch mucosas were treated with 0.5% DMBA 3 times a week for 15 weeks. For the experimental and the control groups，6 hamsters were randomly selected and killed after 6 weeks，9 weeks，12 weeks and 15 weeks. For the solvent control group，3 hamsters were killed each time. The morphological and histological changes of buccal pouch mucosa were dynamic observed under naked eye and light microscope. RESULTS：Compared with the control group，a series of abnormal changes was consecutively observed in the experimental group：hyperemia，incrassation，festering Canker，leukoplakia， Cauliflower shape vegetations. The stages of histological changes had the simple hyperplasia(6th-9thweek)，the epithelial dysplasia of different degrees(9th-12thweek)，carcinoma in situ and squamous cell carcinomas (12th-15thweek). CONCLUSION：Our experimental model shows similar changes to that of human oral squamous cell carcinoma. Therefore，the model can be used to study oral squamous cell carcinoma in multi-stage and multi-step dynamic development.

【KEY WORDS】Chinese hamster； buccal pouch mucosa；oral squamous cell carcinoma；dimethylbenzanthracene；animal m odel

口腔癌是全球第6大常見惡性腫瘤，全世界每年估計(jì)有27.5萬(wàn)例新增病例和12.8萬(wàn)例死亡人數(shù)，已成為一個(gè)重要的全球性健康問(wèn)題[1]?？谇火つぐ┦且环N發(fā)病率高、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移較快的黏膜上皮性腫瘤，絕大多數(shù)為口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，目前臨床療效不佳，中期患者預(yù)后較差、生存率低[2]，因而有必要建立口腔黏膜癌模型來(lái)滿足口腔癌的研究需要。基礎(chǔ)及臨床研究均證實(shí)口腔黏膜癌變是一個(gè)多階段、多步驟的動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程[3-6]，但目前仍缺乏更細(xì)致全面的癌變動(dòng)態(tài)觀察。國(guó)內(nèi)主要有金黃地鼠口腔頰囊黏膜癌前病變及鱗癌等動(dòng)物模型[7-9]。根據(jù)中國(guó)地鼠雙側(cè)頰囊菲薄，血管豐富，便于牽出的優(yōu)勢(shì)，我們采用0.5%二甲基苯并蒽 (9，10-dimethyl-1，2-benzanthracene，DMBA)通過(guò)雙側(cè)頰囊涂抹的方式建立口腔頰囊黏膜癌前病變及鱗癌中國(guó)地鼠模型，對(duì)其癌變過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察分析，旨在研究口腔癌動(dòng)態(tài)發(fā)展的病理形態(tài)變化，為探討口腔癌的發(fā)病機(jī)制，監(jiān)測(cè)癌前病變惡化及對(duì)口腔癌的治療和預(yù)防提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

清潔級(jí)健康雄性中國(guó)地鼠60只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK晉2015-0001)， 體質(zhì)量21~25 g，8~10周齡，在干燥、空氣流通、24 h 光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。將DMBA(美國(guó)Sigma公司)與分析純丙酮溶液配制成5 g/L的DMBA丙酮溶液。

1.2 分組及HE染色

隨機(jī)將60只雄性中國(guó)地鼠分為3組，分別為模型組(24只)、溶劑對(duì)照組(12只)、空白對(duì)照組(24只)。每周一、三、五上午9：00用小頭棉簽在模型組地鼠雙側(cè)頰囊涂擦0.5% DMBA丙酮液，用洗耳球吹干并禁食禁水2 h；溶劑對(duì)照組僅涂丙酮液；空白對(duì)照組不作任何處理。分別于第6、9、12、15周將模型組和空白對(duì)照組隨機(jī)處死6只，溶劑對(duì)照組隨機(jī)處死3只，取口腔一側(cè)完整頰囊黏膜組織于10%的中性福爾馬林溶液中固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片。

1.3 實(shí)驗(yàn)觀察

1.3.1 肉眼觀察 實(shí)驗(yàn)中每天觀察記錄中國(guó)地鼠的精神狀況、毛色情況及進(jìn)食飲水量，重點(diǎn)觀察口腔內(nèi)黏膜變化，觀察是否出現(xiàn)充血、黏膜增厚、潰爛化膿、白斑及菜花狀贅生物等變化。

1.3.2 光鏡觀察 每例在光鏡下觀察3個(gè)視野，將病理改變按WHO標(biāo)準(zhǔn)的12項(xiàng)分級(jí)記錄進(jìn)行判定[10]，分為單純性上皮增生，異常增生(輕、中、重度)，原位癌和鱗癌。

2 結(jié) 果

2.1 中國(guó)地鼠基本情況及頰囊形態(tài)學(xué)改變

空白對(duì)照組中國(guó)地鼠精神、食欲、靈敏度良好，毛色光滑明亮。實(shí)驗(yàn)始末頰囊黏膜未見潰爛及新生物，光滑紅潤(rùn)，乳膜下血管清晰可見，與鄰近組織無(wú)明顯差異(圖1A)。溶劑對(duì)照組形態(tài)、質(zhì)地與空白對(duì)照組一致(圖1B)。而模型組在DMBA持續(xù)作用下中國(guó)地鼠變得精神萎靡、食欲不佳、活動(dòng)遲緩，毛色晦暗粗糙，明顯消瘦。在給藥第3～4周時(shí)，頰囊黏膜出現(xiàn)輕度的充血及水腫；5～6周時(shí)黏膜逐漸變粗糙，增厚不明顯，黏膜光滑紅潤(rùn)，彈性較好，可見黏膜下血管(圖1C)；第9周時(shí)黏膜明顯增厚，在粗糙的基礎(chǔ)上出現(xiàn)不規(guī)則的糜爛面和淺表潰瘍，局部可見有白色斑塊病損，涂擦?xí)r容易出血(圖1D)；12周時(shí)表面可見大量粗糙突出的白色斑塊病損，糜爛和潰瘍?cè)龃?，部分出現(xiàn)贅生物，探之易出血，黏膜彈性降低(圖1E)；第15周時(shí)地鼠腮幫腫大，大多數(shù)黏膜有贅生物，開始形成黃豆大小的腫塊，表面呈菜花狀，質(zhì)地較硬，并不斷增大，手術(shù)分離黏膜時(shí)，極脆易碎。病變頰囊趨于黏連生長(zhǎng)，頰囊袋子變小變淺，出現(xiàn)癌性潰瘍，中央潰瘍，周圍有硬結(jié)(圖1F)。

2.2 中國(guó)地鼠頰囊組織病理學(xué)改變

正常中國(guó)地鼠頰囊黏膜組織病理學(xué)上為3～5層細(xì)胞組成的復(fù)層角化鱗狀上皮，上皮和肌層之間為薄層結(jié)締組織，有少量散在的纖維細(xì)胞和血管，基底細(xì)胞排列整齊，無(wú)釘突或釘突不明顯。棘細(xì)胞層較薄，基底層細(xì)胞明顯，類似人的正常黏膜。溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組相同，光鏡下組織學(xué)表現(xiàn)與正常黏膜一致，無(wú)異常改變(圖2A和B)。

模型組在第6周時(shí)組織病理檢查見黏膜上皮粒層和棘層呈團(tuán)塊狀增厚，粒層細(xì)胞明顯?；准?xì)胞層增厚，細(xì)胞形態(tài)正常，基底膜仍整齊清晰。黏膜下散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，一些血管充血及有血細(xì)胞滲出。極少數(shù)頰囊黏膜表現(xiàn)為非典型性增生，釘突形成(圖2C)。

在第9周時(shí)多數(shù)上皮角化層增厚，呈過(guò)度正角化，少數(shù)錯(cuò)角化。上皮層次不明顯，黏膜上皮粒層和棘層細(xì)胞明顯增厚，基底細(xì)胞增生呈明顯復(fù)層樣改變，多數(shù)基底細(xì)胞極性消失，但基底膜清楚未見破壞，上皮釘突增寬，呈釘狀和乳頭狀。上皮細(xì)胞體積變大，細(xì)胞形態(tài)不一，胞漿豐富，核漿比例倒置，細(xì)胞核濃染，嗜堿性增強(qiáng)。黏膜下層有中度炎性浸潤(rùn)，漿細(xì)胞浸潤(rùn)。鏡下偶見上皮萎縮，固有層呈明顯炎癥細(xì)胞反應(yīng)，為潰瘍組織學(xué)表現(xiàn)(圖2D和E)。

A：空白對(duì)照組；B：溶劑對(duì)照組；C：模型組第6周；D：模型組第9周；E：模型組第12周；F：模型組第15周.圖1 中國(guó)地鼠頰囊黏膜癌變的大體觀察

第12周時(shí)上皮明顯增生，分層紊亂，過(guò)角化、錯(cuò)角化嚴(yán)重，有些部分形成“V字形過(guò)角化”，棘細(xì)胞層出現(xiàn)單個(gè)或成團(tuán)細(xì)胞角化。基底層細(xì)胞增厚，異常增生的細(xì)胞累及上皮2/3以上，大量細(xì)胞極向消失，排列紊亂。上皮細(xì)胞間附著減弱或消失，細(xì)胞間距增大，偶見上皮裂隙，形態(tài)大小不一，上皮細(xì)胞核欠規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核大深染，核漿比例改變，有絲分裂相增加。固有層可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。上皮釘突肥大延伸呈足狀和水滴狀，但基底膜仍完整，未侵入黏膜下層，呈中重度異常增生改變。嗜堿性增強(qiáng)。少數(shù)非典型增生累及上皮全層，滴狀釘突形成并有“滴脫落”現(xiàn)象，為原位癌(圖2F和G)。

第15周時(shí)上皮細(xì)胞與胞核呈明顯多形性表現(xiàn)，上皮增殖并突破基底膜侵入固有層及結(jié)締組織內(nèi)，可見數(shù)個(gè)腫瘤島，伴隨初期角化和非典型的核分裂，核仁增大，呈高分化鱗狀細(xì)胞癌和接近肌層的浸潤(rùn)癌(圖2H)。

A：空白對(duì)照組；B：溶劑對(duì)照組；C：模型組第6周；D：模型組第9周；E：模型組第9周；F：模型組第12周；G：模型組第12周；H：模型組第15周.圖2 中國(guó)地鼠頰囊黏膜癌變的組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，大約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%，手術(shù)、放化療是主要治療方式，但預(yù)后不佳[11-13]?？谇击[狀細(xì)胞癌手術(shù)治療帶來(lái)的咀嚼、吞咽、語(yǔ)言等功能障礙及容貌畸形，嚴(yán)重影響患者的術(shù)后生存質(zhì)量，術(shù)后5年生存率通常在60%左右，晚期患者僅20%~40%[14-15]。充分認(rèn)識(shí)口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找早期診斷指標(biāo)，特別是進(jìn)行口腔鱗狀細(xì)胞癌不同分化程度的診斷和針對(duì)性治療，成為了頭頸部鱗癌研究中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

頰黏膜鱗癌是一類侵襲性較強(qiáng)、復(fù)發(fā)率較高的惡性腫瘤，是我國(guó)的常見惡性腫瘤，但相關(guān)報(bào)道比較有限[16-17]。人頰黏膜鱗狀細(xì)胞癌變過(guò)程是由正?？谇火つど掀ぁつど掀渭?cè)錾つど掀ぎ惓Ｔ錾谇击[癌的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[18-19]。本實(shí)驗(yàn)用DMBA成功地誘發(fā)了中國(guó)地鼠頰囊黏膜癌，經(jīng)組織學(xué)觀察相似于人類頰黏膜鱗狀細(xì)胞癌。目前暫無(wú)有關(guān)DMBA誘導(dǎo)中國(guó)地鼠頰囊黏膜癌的報(bào)道。中國(guó)地鼠較以往實(shí)驗(yàn)常用的金黃地鼠生命力更強(qiáng)、易于飼養(yǎng)；個(gè)體較小，易于單手操作；兩側(cè)頰囊容易牽引翻脫、血管豐富，是微循環(huán)研究、免疫學(xué)研究和腫瘤移植的理想直觀部位，腫瘤易于觀察和切取，是實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[20]； 口腔黏膜與人類十分相似，可模擬人類口腔癌變過(guò)程。因此可作為口腔黏膜癌模型研究，該動(dòng)物模型的建立有助于我們對(duì)口腔癌變這一發(fā)生、發(fā)展過(guò)程進(jìn)行更為詳細(xì)的多階段、多步驟的動(dòng)態(tài)觀察。

本研究用DMBA涂擦中國(guó)地鼠頰囊黏膜建立的口腔頰黏膜癌前病變和鱗癌模型作為研究對(duì)象，通過(guò)定期處死動(dòng)物，分別從肉眼下和光鏡下兩方面動(dòng)態(tài)觀察了中國(guó)地鼠口腔頰囊黏膜癌變的全過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肉眼下中國(guó)地鼠頰囊黏膜在15周中經(jīng)歷了正?！溲?、糜爛、化膿—增厚、粗糙—白斑樣改變—菜花狀新生物的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在DMBA的連續(xù)作用下，口腔頰囊黏膜的彈性緩慢下降，黏膜粗糙性、厚度、糜爛面、潰瘍面及白色斑塊等嚴(yán)重程度均呈穩(wěn)定性增長(zhǎng)，頰囊黏膜與周圍組織分界不清，并最終出現(xiàn)惡性病變。光鏡下對(duì) DMBA 涂擦中國(guó)地鼠頰囊黏膜的顯微組織學(xué)觀察表明：依次經(jīng)過(guò)正常上皮細(xì)胞—單純?cè)錾惓Ｔ錾?輕度—中度—重度)—原位癌—浸潤(rùn)癌的序列變化。按WHO癌前病變的判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，6周時(shí)主要為單純性上皮增生，9周時(shí)呈輕度上皮異常增生和中度上皮異常增生，12周時(shí)呈中度上皮異常增生，部分出現(xiàn)原位癌，15周時(shí)已發(fā)生癌變，癌細(xì)胞突破基底膜侵入固有層及結(jié)締組織內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)開始1~6周內(nèi)，上皮細(xì)胞的形態(tài)呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，改變不明顯，在9周以后逐漸出現(xiàn)不典型增生，并逐漸嚴(yán)重發(fā)展為癌。因此，本次實(shí)驗(yàn)建模成功，癌變過(guò)程的連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察為口腔頰黏膜癌前病變的早期診斷提供參考，為下一步從轉(zhuǎn)錄水平探索口腔黏膜癌變的發(fā)病機(jī)制和尋找更科學(xué)合理有效的腫瘤標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)，為口腔黏膜癌變的治療和預(yù)后提供有益的方法和思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Rahamthulla SA，Priya PV，Hussain SM，et al. Effectiveness of the supraomohyoid neck dissection in clinically N0 neck patients with squamous cell carcinoma of buccal mucosa and gingivobuccal sulcus[J]. J Int Soc Prev Community Dent，2015，5(2)：131-140.

[2] 鐘來(lái)平，鄭家偉，張陳平. 口腔癌早期診斷的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)口腔頜面外科雜志，2007，5(4)：243-247.

[3] Xu Q，Gao Z，Tang D. Expression of E-cadherin and vimentin in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8(3)：3150-3154.

[4] Ragin CC，Modugno F，Gollin SM. The epidemiology and risk factors of head and neck cancer：a focus on human papilloma virus[ J]. J Dent Res，2007，86(2)：104-114.

[5] Choi S，Myers JN. Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma：implications for therapy[J]. J Dent Res，2008，87(1)：14-32.

[6] Gao Y，Zhang R，Zhang J，et al. Study of the extraction process and in vivo inhibitory effect of ganoderma triterpenes in oral mucosa cancer[J]. Molecules，2011，16(7)：5315-5332.

[7] 李志革，張寶平，張 紅. 兩種建立金黃地鼠頰囊癌模型方法的對(duì)照研究[J]. 腫 瘤防治研究，2012，39(3)：267-271.

[8] 李永生，楊 燕. DMBA誘發(fā)金黃地鼠頰囊癌的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)癌癥雜志，2003，13(2)：150-152.

[9] 仇永樂(lè)，劉鐵軍，吳景景. 金黃地鼠頰黏膜癌前病變的組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 口 腔醫(yī)學(xué)研究，2014，30(9)：811-813.

[10] WHO Collaborating Centre for Oral Precancerous Lesions. Definition of leukoplakia and related lesions；an aid to studies on oral precancer[J]. Oral Surg，1978，46(4)：518-539.

[11] Kademani D，Bell RB，Scbmidt BL，et al. Oral and maxillofacial s urgeons t reating o ral c ancer：a p reliminary r eport from the American association of oral and maxillofacial surgeons task force on oral cancer[J]. J Oral Maxillofac Surg，2008，66(10)：2151-2157.

[12] 梅 杰，張國(guó)棟，楊 凱. DMBA誘導(dǎo)金黃地鼠頰囊癌變的組織學(xué)動(dòng)態(tài)變化研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(7)：1018-1021.

[13] Vieira FL，Vieira BJ，Guimaraes MA. Cellular profile of the peritumoral inflammatory infiltrate in squamous cells carcinoma of oral mucosa：Correlationwith the expression of Ki67 and histologic grading[J]. BMC Oral Health，2008，8：25.

[14] 顧文莉，葉東霞，吳靜靜. microRNA-125b在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者血漿中的表達(dá)及意義[J]. 上?？谇会t(yī)學(xué)，2015，24(1)：71-75.

[15] Lim YC，Choi EC. Surgery alone for squamous cell carcinoma of the oral cavity：survival rates，recurrence patterns，and salvage treatment[J]. A cta O tolaryngol，2008，128(10)：1 132-1137.

[16] Lin CS，Jen YM，Cheng MF，et al. Squamous cell carcinoma of the buccal mucosa：an aggressive cancer requiring multimodality treatment[J]. H ead N eck，2006，28(2)：150-157.

[17] Fang QG，Shi S，Li ZN，et al. Squamous cell carcinoma of the buccal mucosa：Analysis of clinical presentation，outcome and prognostic factors[J]. Mol Clin Oncol，2013，1(3)：531-534.

[18] 董玉英，王 潔，董福生，等. 頰癌P16及P53蛋白表達(dá)與臨床病理的相關(guān)研究[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，20(5)： 519-522.

[19] Pujari RK，Vanaki SS，Puranik RS，et al. Histomorphometric analysis of vascularity in normal buccal mucosa， leukoplakia，and squamous cell carcinoma of buccal mucosa[J]. J Oral Maxillofac Pathol，2013，17(3)：334-339.

[20] 王照南，薄家璐，郭守明. 短尾黑線倉(cāng)鼠在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J]. 生 物學(xué)通報(bào)，1997，32(3)：14-15.

基金項(xiàng)目：山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)(2014k08，2015k03)

收稿日期：2015-09-25；

修訂日期：2015-12-01

中圖分類號(hào)：R73-3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0056-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.012