龍牙木總皂苷對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞線粒體細胞色素C和膜電位的影響及其作用機制*

譚玉婷，魯衛星，趙俊男

1 北京中醫藥大學，北京100029；2 北京中醫藥大學第三附屬醫院

譚玉婷1，魯衛星2△，趙俊男1

1 北京中醫藥大學，北京100029；2 北京中醫藥大學第三附屬醫院

目的：觀察龍牙木總皂苷、MitoKATP激活劑二氮嗪(DZ)、MitoKATP抑制劑5-羥基癸酸(5-HD)、龍牙+5-HD對大鼠缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)心肌線粒體細胞色素C和膜電位的影響，并探討龍牙木總皂苷在減輕MIRI中的作用及其機制。方法：將60只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組(假手術組)、模型組、DZ組、5-HD組、龍牙組和龍牙+5-HD組，每組10只，建立Langendorff離體心臟灌流模型。對照組只穿線不結扎，以改良K-H液持續平衡灌流105分鐘；其余5組均穿線結扎冠狀動脈停灌30分鐘，再分別以改良K-H液、DZ、5-HD、龍牙木總皂苷、龍牙+ 5-HD復灌75分鐘(其中龍牙+ 5-HD組以5-HD復灌15分鐘繼以龍牙木總皂苷復灌60分鐘)。提取線粒體，western-blot半定量測定線粒體內細胞色素C水平，熒光酶標儀測線粒體膜電位。結果：龍牙組線粒體細胞色素C釋放減少，膜電位較高，與模型組、5-HD組、龍牙+ 5-HD組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，與DZ組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。結論：龍牙木總皂苷在MIRI時起到保護作用，能減少MIRI時細胞色素C的釋放，穩定線粒體膜電位，其作用可能與mitoKATP的開放有關。

龍牙木總皂苷；缺血再灌注損傷；線粒體；細胞色素C；膜電位

近年來冠心病(CHD)發病人數日漸增多，急性心肌梗死(AMI)患者呈多發、高危、集中的趨勢，在臨床上也常以AMI的死亡率來代表冠心病的死亡率。隨著溶栓療法、經皮冠狀動脈介入治療、冠脈搭橋、心肺腦復蘇、心臟外科體外循環等治療手段在心血管疾病治療中的應用越來越廣泛，如何防治缺血再灌注損傷(IRI)成為臨床常見問題。線粒體是細胞進行氧化磷酸化反應的主要場所，同時也是心肌能量供應場所，在維持鈣穩態的平衡、調控膜電位、抑制細胞凋亡、進行細胞內信息傳遞等方面發揮重要的作用，線粒體結構和功能的變化是IRI發生和發展的重要因素。線粒體內膜上存在ATP敏感性鉀通道 (MitoKATP)，MitoKATP是一種受細胞內ATP調控，對K+高度通透的(聚)多亞基蛋白復合體［1］，對生物膜的穩定性、線粒體及心肌細胞正常功能的維持都有非常重要的作用。研究表明，MitoKATP是IRI防治的重要靶點，開放MitoKATP對缺血再灌注損傷心肌有保護作用。細胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，釋放到胞質后觸發Caspase級聯，導致細胞程序性死亡［2］。膜電位是評價線粒體的重要指標，反映線粒體的功能。龍牙楤木總皂苷為五加科植物，味辛性平有小毒，具有補氣安神，強精滋腎，祛風除濕，活血止痛，健胃利水之功，現代藥理研究表明其有抗心肌缺血的作用［3］。本文通過測定大鼠缺血再灌注損傷(MIRI)心肌細胞線粒體中細胞色素C的相對表達量及線粒體膜電位，探討龍牙楤木總皂苷在MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性Wistar大鼠60只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2009-0007。

1.2 試劑 線粒體-胞漿蛋白制備試劑盒(C1260)、RIPA裂解緩沖液(C1053)、蛋白酶抑制劑混合物(P1265)、BCA法蛋白定量試劑盒(P1511)、5×SDS-PAGE非還原性蛋白上樣緩沖液(B1030)、1M Tris-Hcl PH6.8(B1002)、1M Tris-Hcl PH8.0 (B1011)、ImBlotter-NC硝酸纖維素膜(P2115)、Super ECL超敏發光液(P1020)、柯達X光膠片(E1112)均購自北京普利萊基因技術有限公司；山羊抗小鼠IgG、5×上樣緩沖液、10×電泳緩沖液、10×TBST 均購自北京賽諾博公司；Cytochrome C (SC-13156)、DAB顯色試劑盒(9017)，購自北京中山金橋生物技術有限公司；線粒體內參COX IV (A01060)，購自武漢艾美捷科技有限公司；彩色預染超低分子蛋白質分子量標準(AR1117)，購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清白蛋白BSA(0332)，購自Amresco；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自北京泛博生物化學有限公司。

1.3 儀器 Langendorff，AD Instruments Pty Ltd實驗室，ML870B2 Langendorff System；恒溫水浴，LETIC公司；蠕動泵，Gilson公司；多導生理儀(美國Biopac公司)；Fresco低溫冷凍離心機(Thermo公司)；全波長酶掃描儀(Thermo公司)；濕轉電泳槽(Cavoy)；電泳儀(Bio-Rad)；37℃生化培育箱(上海福瑪實驗設備有限公司)；水平脫色搖床、渦旋震蕩器，其林貝爾儀器制造有限公司；熒光分光光度計(Hitachi Limited公司)；核酸蛋白分析儀(Beckman Coulter公司)；電子顯微鏡(奧林巴斯公司)；保濕盒(協力塑料制品廠)；石蠟切片機、自動封片機，Leica公司；手持電動勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；10、200 μL、1 mL移液槍(Eppendorf)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 采用隨機數字表法將大鼠隨機分為6組，分別為對照組、模型組、DZ組、5-HD組、龍牙組和龍牙+ 5-HD組，每組10只。

1.4.2 動物模型制備 建立Langendorff離體心臟灌流模型。將大鼠稱重，1×103U/kg腹腔注射肝素，充分肝素化后按1 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉。動物固定，開胸暴露主動脈弓，鑷子夾緊主動脈弓分支前，剪斷主動脈，將取下的心臟放入預冷的K-H液中去血。提著主動脈斷端插入Langendorff灌注管中，0號線固定心臟，逆行灌入含有95% O2和CO2的37℃K-H液平衡20分鐘(流速為10 mL/min)。剪開右心耳流出灌流液，剪開左心耳，破開二尖瓣，將心室內壓球囊放入左心室，壓力感受器連接多導生理儀，記錄心臟電生理活動。入組標準為：心律齊，心率≥220次/min，左室收縮壓≥60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)［4］。對照組：只穿線不結扎，以改良K-H液持續平衡灌流105分鐘。模型組：穿線結扎冠狀動脈左前降支近分支處停灌30分鐘，K-H液復灌75分鐘。DZ組：穿線結扎冠狀動脈左前降支近分支處停灌30分鐘，以含50 μmol/L二氮嗪的K-H液復灌75分鐘。5-HD組：穿線結扎冠狀動脈左前降支近分支處停灌30分鐘，以含100 μmol/L 5-HD的K-H液復灌75分鐘。龍牙組：穿線結扎冠狀動脈左前降支近分支處停灌30分鐘，以含5 mg/L龍牙楤木總皂苷的K-H液復灌75分鐘。龍牙+5-HD組：穿線結扎冠狀動脈左前降支近分支處停灌30分鐘，先予含100 μmol/L 5-HD的K-H液復灌15分鐘，再以含5 mg/L龍牙楤木總皂苷的K-H液復灌60分鐘。

1.4.3 線粒體內蛋白的提取 從液氮罐中取出凍存的心肌組織，稱重后放在平皿內，迅速在冰上將其剪成碎塊，放入預冷的玻璃勻漿器中。加入1.5 mL預冷的mito solution，在冰水浴中上下研磨20次左右至漿液狀，將其移入離心管中。4℃離心機離心5分鐘。棄沉淀，上清轉移到新的離心管中。4℃離心機再次離心5分鐘，棄去沉淀，上清轉移到新的離心管。4℃離心機離心10分鐘，上清為胞漿成分，沉淀即為線粒體。沉淀中加200 μLmito solution，渦旋震蕩，4℃離心機離心10 分鐘進行線粒體的洗滌，棄去上清，沉淀為洗滌后的線粒體。沉淀中加入100 μL RIPA裂解緩沖液，渦旋震蕩，冰水浴中靜置10分鐘，4℃離心機離心10分鐘，上清為裂解的線粒體，吸取分裝。

1.4.4 蛋白定量 (BCA法) 將標準蛋白倍比稀釋，線粒體蛋白進行10倍稀釋。BCA Reagent與Cu Reagent 50∶1混合配成工作液。96孔板中加入工作液和標準品、樣品，37℃反應30分鐘。放入酶標儀中，測570 nm的光密度(OD)值，繪制標準曲線，計算出樣品的實際蛋白濃度(mg/mL)。

1.4.5 western-blot半定量測線粒體內細胞色素C 配15%分離膠和5%濃縮膠，線粒體蛋白上樣。電泳恒壓100 mV，跑至濃縮膠和分離膠之間改為恒壓170 mV，繼續電泳時間約1小時。恒流300 mA轉膜1小時，轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。洗去麗春紅染液，將膜完全浸沒在3%BSA-TBST中，室溫輕搖30分鐘進行封閉。孵育一抗，一抗(Cytochrome C)稀釋滴度為1∶40 000(線粒體)，線粒體內參COX IV(鼠單抗)稀釋滴度為1∶5 000。室溫孵育10分鐘，放4℃過夜。第2天從4℃拿出膜，TBST洗5次，10 min/次。5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗(山羊抗鼠IgG，HRP標記)，二抗稀釋滴度為1∶10 000，孵育1小時。

TBST洗膜6次，5 min/次。ECL顯影，光密度掃描定量分析。

1.4.6 線粒體膜電位的測定 應用上海杰美基因提供的線粒體提取試劑盒提取純化線粒體。線粒體膜電位檢測試劑盒 (JC-1)檢測線粒體膜電位：1)JC-1染色工作液(200×)在25℃水浴箱中完全溶解，按每50 μL加入8 mL超純水的比例稀釋JC-1，渦旋振蕩充分混勻，將配好的JC-1染色工作液用JC-1染色緩沖液5倍稀釋，冰槽靜置。2) 0.9 mLJC-1染色工作液加入0.1 mL總蛋白量為10～100 μg純化線粒體。3)熒光酶標儀檢測：檢測JC-1單體時將激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm。檢測JC-1聚合物時將激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以表示，組間比較用單因素方差分析或秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線粒體內細胞色素C表達 線粒體細胞色素C相對量模型組低于對照組、DZ組和龍牙組，差異有統計學意義(P＜0.05)；模型組高于5-HD組、龍牙+5-HD組，差異有統計學意義(P＜0.05)；DZ組與龍牙組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。5-HD組與龍牙+ 5-HD組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1、圖1—2。

表1 線粒體和胞漿細胞色素C表達相對量

表1 線粒體和胞漿細胞色素C表達相對量

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；△表示與模型組比較，P＜0.01；☆表示與模型組、DZ組、龍牙組比較，P＜0.01；●表示與DZ組比較，P＞0.05；▲表示與5-HD組比較，P＞0.05 (下同)。

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圖1 線粒體細胞色素C及內參COXIV

圖2 線粒體細胞色素C相對表達量

2.2 線粒體膜電位 用綠紅熒光的相對比例衡量膜電位，激發光490 nm發射光530 nm得到的數值與激發光525 nm發射光590 nm得到的數值作一個相對值，數值越大，膜電位越低。結果顯示模型組膜電位明顯降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。DZ組、龍牙組膜電位有所下降，與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。5-HD組、5龍組膜電位明顯降低，與模型組、DZ組、龍牙組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。DZ組與龍牙組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。5-HD組與5龍組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2、圖3。

表2 線粒體膜電位

表2 線粒體膜電位

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圖3 線粒體膜電位

3 討論

細胞色素C是呼吸鏈中傳遞電子的載體，它結合于線粒體內膜的外側而不能通過外膜。國內外的大量研究已證實MitoKATP在心肌缺血再灌注損傷中有重要的保護作用，抑制MitoKATP能夠促使線粒體膜電位崩潰和細胞色素C的釋放［3-6］。釋放到胞漿中的細胞色素C與細胞凋亡蛋白活化因子Apaf-1聚合，激活Caspase-9及Caspase-3，引起Caspase級聯反應［7］，引發細胞凋亡。楊睿瑤［8］通過建立大鼠在體缺血再灌注損傷模型并給予心肌缺血預處理，觀察細胞色素C的表達，得出細胞色素C與細胞凋亡關系密切，MitoKATP開放劑二氮嗪能有效保護心肌缺血再灌注損傷。本實驗通過western-blot免疫印跡檢測線粒體中細胞色素C的相對含量，得出MIRI發生時，線粒體釋放細胞色素C到胞漿中，本來在胞漿中含量極少的細胞色素C增加，MitoKATP激活劑二氮嗪和龍牙楤木總皂苷能明顯減少細胞色素C的釋放，保護線粒體功能，減輕MIRI，但這種作用會被MitoKATP抑制劑所抑制。

線粒體跨膜電位(△Ψm)的形成是由位于線粒體內膜的質子泵將線粒體內的質子泵到外室形成的，跨膜電位內負外正。正常的跨膜電位是維持線粒體功能所必須的。當MIRI發生時，氧自由基使線粒體膜發生脂質過氧化反應，大量Ca2+進入線粒體內，激活磷脂酶進一步損傷膜磷脂，線粒體膜通透性增加，膜內外的電勢差下降，膜電位降低，線粒體正常功能受到嚴重損傷。Ozcan等［9］發現二氮嗪預處理后的缺血再灌注大鼠ROS明顯減少，這種作用能被MitoKATP抑制劑5-HD拮抗。Calderone等［10］通過實驗證實MitoKATP開放劑二氮嗪在心肌缺血再灌注大鼠能降低線粒體內Ca2+的含量，這種作用與二氮嗪用量呈正相關。MitoKATP對跨膜電位的穩定作用可能與減輕氧化應激和鈣損傷有關。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生綠色熒光，常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例，從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。本實驗說明MIRI發生時，線粒體膜電位明顯下降，龍牙楤木總皂苷能減輕膜電位降低，穩定線粒體膜，保護線粒體功能。

本實驗結果證實龍牙楤木總皂苷能夠在MIRI起到保護作用，能減少MIRI時細胞色素C的釋放，穩定線粒體膜電位，其作用可能與MitoKATP的開放有關。本實驗為中醫藥防治缺血再灌注損傷提供了新的思路和方法，但仍有尚未解決的問題有待繼續探索。

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［4］ 李寒，徐序杰，張載高.離體心臟灌注模型的制備［J］.海軍總醫院學報，2006，19(3)：133-135.

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Study of Effects and Function Mechanism of Aralosides on Mitochondrial Cytochrome C and Membrane Potential of IRI Rat Cardiac Muscle Cells

TAN Yuting1,LU Weixing2△,ZHAO Junnan1
1 Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2 The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine

Objective: To observe the effects of aralosides, MitoKATPDZX, MitoKATP5-HD, LongYa plus 5-HD on mitochondrial cytochrome C and membrane potential of IRI rat cardiac muscle cells, and explore the function and mechanism of aralosides on relieving MIRI. Methods: All 60 male wister rats were randomly divided into the control group( sham operation group), the model group, DZ group, 5-HD group, aralosides group, aralosides plus 5-HD group, each group 10 rats, Langendorff reperfusion model in isolated heart was built. The control group was given threading, not ligation, persistent and balanced perfusion by improved K-H liquid for 105 min. The other five groups were given threading and ligation for coronary artery, perfusion stopped for 30 min, then reperfusion by improved K-H liquid, DZ, 5-HD, aralosides and aralosides plus 5-HD for 75 min( the aralosides plus 5-HD group was reperfused for 15 min, also reperfused by aralosides for 60 min). Mitochondria were extracted, mitochondrial cytochrome C was measured by western-blot semiquantitative analysis. Mitochondrial membrane potential was measured by microplate system. Results: The release of mitochondrial cytochrome C in aralosides group reduced, membrane potential increased, compared with the control group, 5-HD group and aralosides plus 5-HD group, there were statistical differences(P＜0.05), compared with DZ group, there were no statistical differences(P＞0.05). Conclusion: Aralosides can protect MIRI, reduce the release of mitochondrial cytochrome C in MIRI, stabilize mitochondrial membrane potential, its function might be related to MitoKATPopen.

aralosides; IRI; mitochondria; cytochrome C; membrane potential

R285.5

A

1004-6852(2016)12-0009-04

2016-07-27

國家自然科學基金課題(編號81273691)。

譚玉婷(1988—)，女，在讀博士研究生。研究方向：心血管疾病的中西醫結合治療。

△通訊作者：魯衛星(1959—)，男，碩士學位，教授，主任醫師。研究方向：心血管疾病的中西醫結合治療。