培養條件對八角內生真菌發酵液抗氧化活性的影響

李海云，袁志林，李子院，阮貴華，郝再彬，，韓衛東（1.桂林理工大學廣西礦冶與環境科學實驗中心，廣西桂林541004；.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541004；.廣西壯藥產業化工程院，廣西柳州54500）

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培養條件對八角內生真菌發酵液抗氧化活性的影響

李海云1，2，袁志林2，李子院2，阮貴華2，郝再彬2，3，韓衛東3
（1.桂林理工大學廣西礦冶與環境科學實驗中心，廣西桂林541004；2.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541004；3.廣西壯藥產業化工程院，廣西柳州545200）

摘要：對八角內生真菌Chaetomiumglobosum BJEF13產抗氧化活性物質的培養條件進行了研究。在篩選確定基礎培養基的基礎上，采用單因素試驗方法考察了培養基組成及搖瓶發酵條件對菌株發酵液抗氧化活性、菌株生長的影響。基礎培養基的篩選結果表明，馬鈴薯葡萄糖培養基、察氏培養基、馬丁培養基、豆芽汁蔗糖培養基等4種常用真菌培養基中，察氏培養基優于其他3種。培養基組成和發酵條件的研究結果表明，當以4 %葡萄糖、0.4 %的蛋白胨、0.1 %K2HPO4、0.05 %KCl、0.05 %MgSO4和0.001 %FeSO4作為搖瓶發酵培養基時，接種量為10 %，裝液量為100 mL/250 mL，在初始pH 為7.5、28℃、150 r/min條件下振蕩培養7 d，該菌株的生長和培養液的抗氧化活性可以達到較好的水平，其生物量平均干重達0.6826g/100mL，5倍稀釋的乙酸乙酯萃取液對DPPH自由基的清除率可達57.51%。

關鍵詞：內生真菌；球毛殼菌；八角；抗氧化；培養條件

內生菌是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內部，而不使宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物[1]，是具有新活性或新結構的天然物質的潛在資源庫，在生物制藥、農業生產及發酵工業等領域的應用前景非常廣闊[2-3]。目前，已在鹽生海蘆筍[4]、蒺藜[5]、銀杏[6]、木豆[7]及其他藥用植物[8]中分離出可產抗氧化活性物質的內生菌。

球毛殼菌Chaetomium globosum是子囊菌中毛殼菌屬的模式種[9]，廣泛分布于自然界中，具有產纖維素酶、分解纖維素的能力，在植物病害生物防治的研究和應用上也占有比較重要的地位[10]。研究表明，球毛殼菌也是一種較常見的植物內生真菌，目前已從多種植物中分離出活性各異的內生球毛殼菌，如鳶尾[11]、美登木[12-13]、油菜[14]、杜仲[15-16]、青檀[17]等。本課題組前期從八角內生真菌中分離獲得一株抗氧化活性較強的菌株BJEF13[18]，經鑒定為Chaetomium globosum。本文對該菌株產抗氧化活性物質的培養條件進行研究，初步獲得該菌株的較優培養工藝條件，為后續研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

內生真菌Chaetomium globosum BJEF13：分離自八角枝，2009年4月采自南寧高峰林場。

1.1.2培養基

斜面及平板培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然）。

液體培養基：馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PD：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然）；察氏培養基（Czapek：NaNO30.2 %，K2HPO40.1 %，KCl 0.05 %，MgSO40.05 %，FeSO40. 001 %，蔗糖3 %，水1 000 mL，自然pH）；馬丁培養基（Martin：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然）；豆芽汁蔗糖培養基（BSS：黃豆芽100 g、蔗糖50 g、水1 000 mL、pH自然）。

1.1.3試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、K2HPO4、KCl、MgSO4、蔗糖、葡萄糖、瓊脂等，所用試劑均為分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.1.4儀器

YXQ.SG41.280B手提式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫用核子儀器有限公司；BS223S型電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；SW-CF-ZF型超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；LRH-150-Z型振蕩培養箱：廣東省醫療器械廠；SPX-250B型生化培養箱：上海躍進醫療器械廠；DL-5-B型離心機：上海安亭科學儀器廠；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司等。

1.2方法

1.2.1菌株的培養及孢子懸液的制備

從內生真菌Chaetomium globosum BJEF13保存斜面中挑取少量菌絲點種于PDA固體培養基上，置于28℃恒溫培養箱中培養4 d，轉接PDA試管斜面，同法培養。

取培養7 d的Chaetomium globosum BJEF13菌株斜面數支，分別加入5mL無菌水，用接種環將孢子輕輕刮下，置于已滅菌的250 mL三角瓶內，瓶中預先放置數粒玻璃珠，充分振搖后，用無菌脫脂棉過濾，采用血球計數法計數并調節孢子濃度為106cfu/mL~108cfu/mL，得孢子懸浮液，置4℃冰箱保存備用。

1.2.2基礎培養基的篩選

以濃度為106cfu/mL~108cfu/mL孢子懸浮液作為接種液，按10 %接種量接種至盛有不同液體培養基（馬鈴薯葡萄糖培養基PD、察氏培養基Czapek、馬丁培養基Martin和豆芽汁蔗糖培養基BSS）的250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL。接種后，于28℃、150 r/min搖床培養。同時留取不接菌的液體培養基作陰性對照。培養7 d后，將Chaetomium globosum BJEF13菌株發酵液在4 500 r/min下離心20 min，分別收集上清液和菌體。

1.2.3培養基組成的影響

在前述所篩基礎培養基的基礎上，分別考察碳源的種類及濃度、氮源的種類及濃度、無機鹽的用量等對Chaetomium globosum BJEF13菌體生長量和發酵液抗氧化活性的影響，確定培養基的組成。發酵條件為：初始pH7.0、發酵溫度28℃、接種量10%、裝液量100mL/ 250 mL、搖床轉速150 r/min、發酵時間7 d。

1.2.4發酵條件的影響

在確定培養基組成的基礎上，分別考察初始pH、發酵溫度、接種量、裝液量、搖床轉速、發酵時間等搖瓶發酵條件對Chaetomium globosum BJEF13菌體生長量和發酵液抗氧化活性的影響。

1.2.5抗氧化活性的測定

發酵上清液經0.22 μm濾膜過濾，得發酵無菌濾液。為盡可能消除培養基成分差異對抗氧化活性測定的影響，吸取1 mL無菌濾液，加入5 mL乙酸乙酯進行萃取，4 500 r/min下離心10 min以促進分層，取上層乙酸乙酯萃取液進行抗氧化活性測定。

以DPPH自由基清除性能作為抗氧化活性指標，參照文獻[19]方法進行測定：吸取0.1 mL發酵液乙酸乙酯萃取液，加入3.9 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液（乙醇為溶劑）。從加入DPPH溶液開始計時，室溫下避光放置90 min后，測定517 nm波長處吸光度，記為A1。另取0.1 mL乙酸乙酯代替乙酸乙酯萃取液同上操作，吸光度記為A0。按下式計算清除率：

1.2.6菌體生長量的測定

取發酵液離心后的沉淀（菌絲），用蒸餾水洗滌3次，置烘箱中80℃烘干至恒重后稱重，計算3次重復的平均值。

2結果與分析

2.1培養基對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

選擇馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）、察氏培養基（Czapek）、馬丁培養基（Martin）和豆芽汁蔗糖培養基（BSS）4種常見真菌培養基，考察了BJEF13在這4種培養基中的生長情況及產物的抗氧化活性，結果如圖1所示。

圖1不同培養基對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.1 Effect of different culture medium on DPPH·scavenging activity and the biomass of BJEF13

從菌體的生長情況看，菌株BJEF13在PD和Czapek兩種培養基中生長較好，經過7 d的發酵培養，PD和Czapek兩種培養基培養物的菌絲干重分別為0.499 6 g/100 mL和0.501 4 g/100 mL。菌株BJEF13在Martin和BSS培養基中生長情況則略差，其菌絲干重分別只有0.464 5 g/100 mL和0.377 4 g/100 mL。從發酵產物對DPPH自由基的清除活性來看，Czapek培養基發酵液的活性最強，清除率可達33.95 %，而其余3種培養基發酵液的活性相差不大，清除率在23.12 % ~ 27.80 %之間。從菌體的生長情況和發酵液DPPH自由基清除活性綜合考慮，選擇Czapek培養基作為條件優化的基礎培養基。

2.2碳源種類對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

在Czapek培養基的基礎上，分別采用3 %葡萄糖、3 %可溶性淀粉、3 %麥芽糖、3 %乳糖、3 %果糖作為供試碳源代替原培養基中的蔗糖，其他組分不變，對菌株BJEF13進行發酵培養，考察碳源種類對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生物量的影響，結果如圖2所示。

圖2不同碳源對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.2 Effect of different carbon source on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

由圖2可知，所選用的6種碳源中，葡糖糖和蔗糖較有利于菌株BJEF13的生長，平均干重分別可達0.507 8 g/100 mL和0.501 4 g/100 mL。DPPH自由基清除率結果表明，葡萄糖為碳源時，發酵液對DPPH自由基清除率最高（35.44 %），蔗糖和麥芽糖次之。可見，以葡萄糖為碳源既有利于菌株BJEF13的生長，又有利于代謝產生抗氧化活性物質。因此選擇葡萄糖為碳源。

2.3氮源種類對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

分別以0.2 %的酵母膏、0.2 %牛肉膏、0.2 %蛋白胨、0.2 %尿素、0.2 %硫酸銨代替原培養基中的硝酸鈉作為供試氮源，以3 %葡萄糖為碳源，其余成分不變，對菌株BJEF13進行發酵培養，考察不同氮源對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生物量的影響，結果如圖3所示。

圖3不同氮源對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

由圖3可知，酵母膏、牛肉膏和蛋白胨等有機氮源有利于菌體的生長和抗氧化活性物質的合成，其中以蛋白胨作為氮源時，菌絲干重雖然略低于酵母膏，但其發酵液的DPPH自由基清除率卻最高。綜合考慮，選取蛋白胨作為氮源。

2.4碳源濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

在選擇葡萄糖為碳源的基礎上，考察不同濃度的葡萄糖對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響，結果如圖4所示。

圖4不同葡萄糖濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.4 Effect of different concentration of glucose on DPPH· scavenging activity and biomass of BJEF13

當葡萄糖濃度為1 %~4 %時，生物量和DPPH自由基清除率均隨著葡萄糖濃度的變大而增大；葡萄糖濃度繼續增大時，菌體生物量略有增大，但DPPH自由基清除率反而下降。因此選擇4 %的葡萄糖濃度作為培養基碳源濃度。

2.5氮源濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

在選擇蛋白胨為氮源的基礎上，考察不同蛋白胨濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生物量的影響，結果如圖5所示。

圖5不同蛋白胨濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.5 Effect of different concentration of peptone on DPPH· scavenging activity and biomass of BJEF13

圖5結果表明，蛋白胨濃度在0.1 %~0.8 %范圍內，生物量和DPPH自由基清除活性均隨蛋白胨濃度的增大而先增大后趨于穩定。當蛋白胨濃度為0.4 %時，DPPH自由基清除率達最大（51.55 %）。因此，選擇0.4 %的蛋白胨濃度作為BJEF13發酵產抗氧化活性物質的氮源。

2.6無機鹽濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

本試驗按照察氏培養基無機鹽總濃度的倍數不添加或添加不同濃度（0.201 %、0.402 %、0.603 %、0.804 %、1.005 %）的無機鹽，以確定無機鹽濃度。結果見圖6。

圖6不同無機鹽濃度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.6 Effect of different concentration of salts on the biomass and DPPH·scavenging activity of BJEF13

圖6結果表明，當不添加無機鹽時，BJEF13菌株的生長明顯受到影響，其菌絲干重只有0.472 1 g/100 mL；當添加無機鹽總濃度為0.2 %時，菌絲干重達最大（0.651 6 g/100 mL）；繼續增大無機鹽用量，其對菌體的生長反而略有抑制。無機鹽對DPPH自由基清除活性影響與生物量類似。因此選擇原配方的無機鹽濃度，即0.1 %K2HPO4，0.05 %KCl，0.05 %MgSO4，0.001 %FeSO4（總濃度0.201 %）作為BJEF13發酵的無機鹽濃度。

2.7初始pH對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

液體培養基初始pH對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生物量的影響如圖7所示。

圖7初始pH對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.7 Effect of initial pH on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

由圖7可見，菌株生長及產抗氧化活性物質的最適初始pH均為7.5。

2.8培養溫度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

液體培養基初始pH對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生物量的影響如圖8所示。

圖8培養溫度對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.8 Effect of culture temperature on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

圖8結果表明，當培養溫度為28℃時，菌株生物量及發酵液抗氧化活性均可達最大值，因此選擇培養溫度為28℃。

2.9接種量對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

以BJEF13成熟孢子液作為種子液，不同接種量對菌體生物量和發酵液抗氧化活性的影響如圖9所示。

圖9接種量對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

圖9結果表明，當接種量低于10 %時，菌體生物量和發酵液抗氧化活性均隨接種量的增大而增大；當接種量大于10 %時，隨著接種量的增大，菌體生物量變化不明顯，而抗氧化活性則逐漸降低。因此，選擇接種量為10 %為宜。

2.10裝液量和搖床轉速對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

分批培養中，裝液量和搖床轉速影響到發酵體系的供氧情況。在本體系中，在250 mL三角瓶中的裝液量及搖床轉速的影響分別如圖10、圖11所示。

由圖10、圖11可見，裝液量為100 mL/250 mL、搖床轉速為150 r/min時，最有利于菌體的生長及抗氧化活性物質的合成。

圖10裝液量對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.10 Effect of liquid volume on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

圖11搖床轉速對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.11 Effect of shaking speed on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

2.11培養時間對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響

BJEF13菌株在不同培養時間下發酵產物抗氧化活性及菌體生物量量的變化如圖12所示。

圖12培養時間對BJEF13發酵產物抗氧化活性及菌體生長量的影響Fig.12 Effect of culture time on DPPH·scavenging activity and biomass of BJEF13

圖12結果表明，在7 d以內，隨著培養時間的延長，菌株的生物量及發酵液的抗氧化活性逐漸增大。抗氧化活性在第7 d時達最大，而生物量則在7d~11 d達穩定，其后開始減小。從抗氧化活性方面考慮，選擇培養時間為7 d。

3　結論

對前期所篩的一株八角內生真菌Chaetomium globosum BJEF13發酵產抗氧化活性物質的培養條件進行了研究。單因素試驗結果表明，碳源、氮源等培養基組分以及初始pH、溫度等發酵條件對該菌株產抗氧化活性物質的影響較大。當以4 %葡萄糖、0.4 %的蛋白胨、0.1 %K2HPO4、0.05 %KCl、0.05 %MgSO4和0.001 % FeSO4作為搖瓶發酵培養基時，接種量為10 %，裝液量為100 mL/250 mL，在初始pH為7.5、28℃、150 r/min條件下振蕩培養7 d，該菌株的生長和培養液的抗氧化活性可以達到較好的水平，其生物量平均干重達0.682 6 g/100 mL，5倍稀釋的乙酸乙酯萃取液對DPPH自由基的清除率可達57.51 %。

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Effect of Culture Conditions on Antioxidative Activity of Fermentation Broth of Endophytic Fungal Isolated from Illicium verum

LI Hai-yun1，2，YUAN Zhi-lin2，LI Zi-yuan2，RUAN Gui-hua2，HAO Zai-bin2，3，HAN Wei-dong3
（1. Guangxi Scientific Experiment Center of Minin，Metallurgy and Environment，Guilin University of Technology，Guilin 541004，Guangxi，China；2. College of Chemistry & Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，Guangxi，China；3. Guangxi Zhuang Medicine Industrial Engineering Institute，Liuzhou 545200，Guangxi，China）

Abstract：Influences of cultural conditions on the production of antioxidant materials by the endophytic fungal Chaetomium globosum BJEF13 isolated from Illicium verum were studied. After screening the basic culture medium，influences of compositions of the cultural medium and fermentation conditions to the dry weight of mycelia and DPPH·scavenging activity were investigated using single factor experiment. The basic culture medium screening results indicated that Czapek culture medium was more suitable for the strain than the other three media，the PD culture medium，Martin culture medium and BSS culture medium. The results of single factor experiments for components of Czapek culture medium indicated that the suitable cultural conditions for the mycelia growth and production of antioxidant materials were as followed：4 % glucose，0.4 % peptone，0.1 % K2HPO4，0.05 % KCl，0.05 % MgSO4，0.001 % FeSO4，initial pH 7.5，temperature 28℃，inoculation amount 10 %，liquid volume 100 mL/250 mL，shaking speed 150 r/min and cultural time 7 days. Under the suitable cultural conditions，the dry weight of mycelia and DPPH·scavenging activity of 5-fold dilution of acetate extract of the broth were 0.682 6 g/100 mL and 57.51 %，respectively.

Key words：endophytic fungal；Chaetomium globosum；Illicium verum；antioxidant activity；cultural condition

收稿日期：2014-08-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.045

作者簡介：李海云（1975—），男（漢），副教授，研究生，主要從事天然活性物質研究。

基金項目：國家自然科學基金項目（31460409）；廣西礦冶與環境科學實驗中心資助項目（KH2013YB013）；廣西壯藥產業化工程院科研項目（2014GXZYCYH03）