UPLC法快速測(cè)定葡萄酒中的防腐劑脫氫乙酸

俞子萱，楊爽，葛寶坤，宋旭（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

?

UPLC法快速測(cè)定葡萄酒中的防腐劑脫氫乙酸

俞子萱，楊爽，葛寶坤*，宋旭
（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

摘要：建立超高效液相色譜法（UPLC）、二極管陣列檢測(cè)器（PAD）快速測(cè)定葡萄酒中防腐劑脫氫乙酸（DHA）的方法。采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（體積比=20∶80，pH=7.5~8.5）作為流動(dòng)相，流速為0.25 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為293nm。該方法以保留時(shí)間（Rt）定性，外標(biāo)法定量，在5.0 mg/L~200.0 mg/L范圍內(nèi)待測(cè)組分的峰面積與濃度有良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2>0.9999，樣品在5.0、10.0、25.0mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平回收率范圍為87.0%~101.2%（n=10），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，該方法的定量限（LOQ）為5.0mg/L。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；脫氫乙酸；超高效液相色譜法；二極管陣列檢測(cè)器

脫氫乙酸（Dehydroacetic acid），別名二乙酰基乙酰乙酸，是一種低毒高效的防腐、防霉劑，防腐效果是苯酸鈉的2倍~10倍，在酸、堿條件下均具有一定的抗菌作用，尤其對(duì)霉菌的抑制作用最強(qiáng)[1-2]，因此，在食品中常被用作防腐劑、防霉劑[3-4]。但脫氫乙酸因具有一定的毒性，其安全性也受到質(zhì)疑[5]；我國(guó)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[6]規(guī)定：脫氫乙酸可用于黃油、醬菜、發(fā)酵豆制品、面包、糕點(diǎn)、焙烤食品餡料、復(fù)合調(diào)味料、果蔬汁。由于脫氫乙酸在該標(biāo)準(zhǔn)中的使用范圍并不包括葡萄酒，因此，脫氫乙酸在葡萄酒中為違規(guī)添加劑。目前，一些葡萄酒生產(chǎn)商利用脫氫乙酸良好防腐效果在葡萄酒中違規(guī)添加[7-8]，因此，建立葡萄酒中脫氫乙酸的測(cè)定方法尤為必要，它可彌補(bǔ)國(guó)標(biāo)方法的不足。目前文獻(xiàn)報(bào)道的脫氫乙酸檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]，但上述方法存在或前處理復(fù)雜、或檢測(cè)速度慢、或靈敏度不高、或不適于葡萄酒等問(wèn)題[11-18]；本文建立了采用UPLC快速測(cè)定葡萄酒中脫氫乙酸的方法，極大地提高分離效率和分析速度，該方法前處理簡(jiǎn)單，分析流程短，檢出限低，回收率高，可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)葡萄酒中的脫氫乙酸。

1材料與方法

1.1儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（PDA）：美國(guó)Waters公司；MILLI-Q純水儀：MILLIPOR公司；8893E-TDH超聲波萃取儀：美國(guó)科爾帕默公司。

1.2試劑

甲醇（色譜純）：北京迪馬科技；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9 %）：CHEM SRVICE公司；乙酸銨、氨水、氫氧化鈉（均為優(yōu)級(jí)純）：天津化學(xué)試劑二廠。

1.3方法

1.3.1樣液的制備

取一定的葡萄酒樣品，超聲波10 min或水浴加熱5 min冷卻，再取1.0 mL樣液用流動(dòng)相對(duì)倍稀釋?zhuān)靹颍ㄈ菀哼^(guò)0.45 μm水系濾膜，進(jìn)UPLC分析測(cè)定。

1.3.2超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters公司，C18柱，1.7μm，2.1mm×100mm，或相當(dāng)者；流動(dòng)相：甲醇∶0.02 mol/L乙酸銨溶液（pH= 7.5~8.5）=20∶80；恒流速：0.25 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1.0 μL；波長(zhǎng)：293 nm。

1.3.3分析測(cè)定

根據(jù)樣液中被測(cè)組分的含量，選擇線(xiàn)性范圍內(nèi)的曲線(xiàn)點(diǎn)，依Rt結(jié)合PDA光譜圖定性、峰面積定量，在1.3.2色譜條件下，DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1、陽(yáng)性樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 5.0 mg/L的DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 5.0 mg/mL DHA standard

圖2 24.5 mg/L的DHA葡萄酒樣品色譜圖Fig.2 24.5 mg/L DHA sample standeard addition

2結(jié)果與討論

2.1前處理方法的優(yōu)化

本論文對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道[6，9]的脫氫乙酸前處理方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大部分試驗(yàn)針對(duì)高蛋白樣品，用氫氧化鈉溶液提取樣品中脫氫乙酸，再經(jīng)脫脂、去蛋白處理后經(jīng)高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定，而此類(lèi)方法操作復(fù)雜，不適用于基質(zhì)簡(jiǎn)單的酒類(lèi)產(chǎn)品中脫氫乙酸的檢測(cè)。研究還發(fā)現(xiàn)去除葡萄酒中乙醇和氣泡主要有加熱法、微波法兩種方法[7，13]。本試驗(yàn)采用上述兩種方式，對(duì)去除的時(shí)間和去除效果的進(jìn)行觀察，研究表明：水浴加熱5 min和微波提取10 min對(duì)脫氫乙酸的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。

2.2色譜柱的選擇

根據(jù)色譜柱類(lèi)型不同，本文分別選取①C18，1.7μm，2.1 mm×100 mm，②C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，③C8，1.7 μm，2.1 mm×100 mm，④C8，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，4種色譜柱，研究其對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。研究表明：與C18柱相比，C8柱對(duì)脫氫乙酸分離度較差，而在長(zhǎng)度為50 mm的色譜柱下脫氫乙酸出峰時(shí)間較快，不能與溶劑峰很好的分離。因此，選用C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm的色譜柱能得到較好的試驗(yàn)結(jié)果。

2.3流動(dòng)相的pH對(duì)分離效果的影響

根據(jù)脫氫乙酸的理化特性，本文研究了流動(dòng)相在pH =3.0~4.5、pH =4.5~6.0、pH =6.0~7.5、pH =7.5~8.5條件下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，研究表明：pH =3.0~4.5、pH = 4.5~6.0 2個(gè)酸度條件下脫氫乙酸容易電離，出現(xiàn)拖尾峰，而pH =6.0~7.0和pH =7.5~8.5時(shí)脫氫乙酸不易電離，峰形呈均勻的正態(tài)分布，在考慮色譜柱的壽命、分離效果以及脫氫乙酸在弱堿性條件下有較好的溶解性，本試驗(yàn)選擇將流動(dòng)相pH=7.5~8.5范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

2.4方法的回收率與精密度

按照1.3.1方法操作，在5.0、10.0、25.0 mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果平均回收率87.0 %~ 101.2 %（n=10），精密度小于3.0 %，方法的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性關(guān)系

取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相稀釋成濃度在5.0 mg/L~200.0 mg/L的范圍內(nèi)，按照本方法色譜條件分析測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，脫氫乙酸在上述濃度范圍內(nèi)有良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=1.33×104X-3.55× 103，其相關(guān)系數(shù)R2大于0.999 9。

2.6方法的檢出限

按上述樣品制備方法，在一系列樣品中加入脫氫乙酸標(biāo)液后，由高濃度到低濃度依次用空白樣液逐級(jí)稀釋?zhuān)靹颉⒍ㄈ荨０凑毡驹囼?yàn)方法和色譜條件分析測(cè)定，根據(jù)選擇合適的噪比S/N=10時(shí)的加標(biāo)濃度計(jì)算本方法的定量限（LOQ）值為5.0 mg/L。

表1方法的靈敏度、線(xiàn)性關(guān)系及回收率（n=10）Table 1 Sensitivities，linearships and recoveries of the method（n=10）

2.7方法的抗干擾能力研究

為了確定本方法的抗干擾能力，采用在葡萄酒樣品中添加一定量且有可能添加的苯甲酸、山梨酸、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、偶氮紅，按照上述方法進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果顯示，上述添加劑均不干擾脫氫乙酸的測(cè)定。

2.8方法的適用性

分別選取進(jìn)口和超市購(gòu)買(mǎi)的常見(jiàn)品牌的干紅、干白、甜白、起泡酒、半干高泡葡萄酒樣品，按照本方法條件進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示在各類(lèi)型葡萄酒中脫氫乙酸的色譜峰分離度和重現(xiàn)性均較好，符合分析方法的要求，因此，本研究建立的方法適用于多種類(lèi)型的葡萄酒中脫氫乙酸的測(cè)定。

3　結(jié)論

本文研究的檢測(cè)脫氫乙酸方法在5.0 mg/L~ 200.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9；樣品在5.0、10.0、25.0 mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平內(nèi)的回收率范圍為87.0 %~101.2 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3 %；方法的定性檢出限（LOD）為2.0 mg/ L、定量檢出限（LOQ）為5.0 mg/L，符合色譜分析的方法要求。本研究方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、不需要SPE凈化柱和昂貴的質(zhì)譜設(shè)備，便于推廣與應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳幸鶯,鐘鵬鵬,王懷智,等.食品中脫氫乙酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].商品與質(zhì)量:學(xué)術(shù)觀察,2013(11):259-260

[2]明立艷.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009,30(3):106-107

[3]張基偉,李淑蘭.食品中多種添加劑的檢驗(yàn)[J].品牌與標(biāo)準(zhǔn)化, 2010(14):43-44

[4]許振午,侍冬陽(yáng).食品中添加劑山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、糖精鈉同時(shí)檢測(cè)方法探討[J].工業(yè)技術(shù),2011(10):57

[5]王峰.超高效液相色譜法測(cè)定食品中的脫氫乙酸[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(16):88-90

[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014

[7]杭莉.高效液相法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中3種防腐劑和2種甜味劑[J].中國(guó)釀造,2014,33(6):144-146

[8]陳曉紅,趙永剛,姚姍姍,等.超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃酒和葡萄酒中的9種防腐劑和甜味劑[J].色譜, 2011, 29(12): 1147-1154

[9]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.121-2003食品中脫氫乙酸的測(cè)定氣相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009:101-104

[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 23377-2009食品中脫氫乙酸的測(cè)定高效液相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009:1-5

[11]王勍.食品中脫氫乙酸測(cè)定的快速前處理方法[J].福建分析測(cè)試, 2010,10(3):62-66

[12]金鑫.對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)脫氫乙酸方法的探究[J].商品與質(zhì)量:學(xué)術(shù)觀察,2013(11):274

[13]陳海元,王永建.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸的pH值探討[J].商品與質(zhì)量:學(xué)術(shù)觀察,2012(7):260

[14]王若燕,王立媛.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量的研究[J].浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào),2003,15(11):97-99

[15]楊紅梅,劉艷琴,殷曉燕,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉以及脫氫乙酸[J].浙食品科技, 2007(10):213-217

[16]徐紅,郭曉霖.用高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸[J].中國(guó)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督,2010(5):62

[17]李琳.液相色譜同測(cè)食品中防腐劑與甜味劑方法研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(13):96-97

[18]胡海燕,朱馨樂(lè),胡昊,等.超高效液相色譜簡(jiǎn)介及應(yīng)用比較[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(4):48-50

Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）Method for Determination of Dehydroacetic Acid（DHA）in Wine

YU Zi-xuan，YANG Shuang，GE Bao-kun*，SONG Xu
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：A method was developed for the rapid determination of dehydroacetic acid（DHA）in wine . The sample was tested by ultra performance liquid chromatography（UPLC）with diode array detector（PDA）. The mobile phase was methanol-0.02 mol/LAmmonium acetate（mL∶mL=20∶80，pH=7.5-8.5），flow rate was 0.25 mL/min，column temperature was 35℃，determine wavelength was 293 nm. The method for qualitative analysis was based on retention time. And external standard method was used for calculation. Good linear relationship was achieved in the range of 5.0 mg/L-200.0 mg/L for DHA with correlation coefficients above 0.999 9. The recoveries of the method ranged from 87.0 % -101.2 %（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）less than 3 % at 3 spiked levels of 5.0，10.0，25.0 mg/L. The limit of quantification（LOQ）was 5.0 mg/L for DHA.

Key words：wine；DHA；UPLC；PDA

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.040

*通信作者：葛寶坤（1968—），男（漢），研究員，致力于食品安全與殘留檢測(cè)技術(shù)。

作者簡(jiǎn)介：俞子萱（1990—），女（蒙古），助理工程師，本科，研究方向：進(jìn)出口酒類(lèi)安全檢測(cè)技術(shù)。