絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷的保護性研究

劉春杰，董立珉，鄭亞萍，康紅鈺（漯河醫學高等專科學校，河南漯河462000）

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絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷的保護性研究

劉春杰，董立珉，鄭亞萍，康紅鈺
（漯河醫學高等專科學校，河南漯河462000）

摘要：觀察絲瓜提取物（Luffaextract，LE）對β-淀粉樣蛋白（Aβ25－35）誘導的PC12細胞損傷的保護作用。應用Aβ25－35造成神經細胞損傷模型，用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應（MTT）比色法檢測各劑量組絲瓜提取物對PC12細胞活力的變化，檢測過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）活性水平，通過蛋白印跡試驗（Western Blotting）來檢測B細胞淋巴瘤基因-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）的表達水平。絲瓜提取物劑量組PC12細胞存活率高于模型組，GSHPx活性顯著增強，CAT含量顯著增加（P<0.01或P<0.05），Bax表達水平降低，Bcl-2表達增高，與模型組比較，差異顯著（P<0.05～P<0.01）。絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷有明顯的保護作用。

關鍵詞：絲瓜提取物；PC12細胞；MTT檢測；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

老年性癡呆（Alzheimer’s disease，AD）的病理性特征是老年斑（senile plaque，SP），而SP的核心成分是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），正常生理情況，Aβ具有營養因子的作用，但高濃度的長鏈Aβ往往具有神經毒性[1]，Aβ的產生、積聚增加是引起神經元退化和死亡的主要機制。Aβ可通過多種途徑產生過氧化物和自由基，從而加劇過氧化損傷對神經細胞的傷害[2]。

絲瓜為葫蘆科植物，近年來證明絲瓜有增強免疫、抗應激、抗病毒、促進生長等生理功能，能促進記憶的獲得、鞏固和再現，有促智作用。絲瓜提取物有明顯抗氧化作用，用于美容可延緩衰老，廣泛用于洗滌日用品[3]。本研究將探討絲瓜提取物對β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）損傷PC12細胞的神經保護作用，初步探討絲瓜提取物對AD的神經保護機制。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

絲瓜提取物：西安森冉生物有限公司；PC12細胞：北京北納創聯生物技術研究院；MTT、Aβ25-35：Sigma公司；CAT、GSH-Px檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；DMEM培養基、胎牛血清、馬血清：杭州四季青工程材料研究所；Bcl-2、Bax抗體：SantaCruz生物技術公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器

UV-9200紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；高速冷凍離心機：上海創賽科學儀器有限公司；電熱恒溫水槽：寧波天恒儀器廠；二氧化碳培養箱：Thermo公司；超凈工作臺：TBD生物儀器廠；EPOCH酶標儀：美國BioTek公司；凝膠掃描成像分析系統：美國startganee。

1.3 PC12細胞培養及建立損傷模型

用含15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基，在37℃、5 %CO2飽和濕度條件下的CO2培養箱中培養，2 d～3 d換液1次，貼壁生長的細胞，加入0.25 %胰蛋白酶消化，細胞調整為1×105個/mL，接種于96孔細胞培養板，培養細胞進入對數生長期細胞，進行各項指標檢測。離體培養的PC12細胞分為6組：空白組、模型組、絲瓜提取物高劑量組、絲瓜提取物中劑量組、絲瓜提取物低劑量組。模型組加入經老化處理的Aβ25-35（終濃度為20 μmol/L）培育36 h，建立AD細胞模型，絲瓜提取物各劑量組分別用終濃度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）過夜培養共2 h后，再加入終濃度為20 μmol/LAβ25-35共同培養36 h，每組8孔，每孔200 μL。

1.4 MTT比色法檢測細胞活力

將處于對數生長期的PC12細胞制成2×105個/mL懸液，置于96孔培養板內進行鋪板，每孔200 μL，分別給與不同處理因素作用24 h，MTT檢測時棄掉上清，再加入培養基180 μL，每孔再加MTT 20 μL，37℃培養4 h，然后吸出培養液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩10 min后在酶標儀于560 nm波長處讀取標本的吸光度，各組的吸光度與對照組的吸光度比值作為細胞的活力。按細胞相對活力計算公式：相對活力/%=[（處理組平均吸光度值－空白對照平均吸光度值）/（正常組平均吸光度值－空白對照組平均吸光度值）]×100。

1.5絲瓜提取物對氧化應激的PC12細胞中抗氧化能力的影響

取對數生長期細胞，用胰酶將細胞制成2×105個/mL懸液并接種于6孔培養板。絲瓜提取物用終濃度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）預處理30 min，再加入終濃度為20μmol/LAβ25-35共同培養24h，完成給藥及Aβ25-35處理后，超聲破碎收集的細胞，4℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒方法測定細胞勻漿中CAT、GSH－Px活力。

1.6 Western blotting分析

加藥處理細胞24 h后，收集細胞并洗滌，SDSPAGE電泳分離總蛋白，蛋白質轉移到PVDF膜，5 %的脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉過的膜用TBST洗滌3次，將膜放入雜交袋內，大鼠Bcl-2、Bax及β-actin-抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記兔抗大鼠IgG 37℃孵育1 h，TBS漂洗，ECL法顯色。凝膠成像系統分析掃描各條帶灰度值，計算目的條帶與內參照的灰度比值。

1.7統計分析

試驗數據均以X±S表示，采用SPSS13.0軟件進行統計分析，t檢驗法比較各組間差異，P＜0.05則認為組間差異顯著。

2　結果

2.1絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞毒性的保護效果

與空白組相比，20 μmol/L的Aβ25-35處理后的細胞存活率明顯下降，僅為55.23 %，具有顯著差異性（P＜0.01）；當PC12預先經絲瓜提取物處理后再加Aβ25-35，細胞存活率顯著增加，并呈現劑量依耐性的趨勢，在絲瓜提取物（30.75、18.75、9.375 μg/mL）處理后細胞存活率分別能達到74.72 %、68.15 %及58.01 %。其中，9.375 μg/mL組與模型組相比，無統計學意義，而絲瓜提取物30.75、18.75 μg/mL可以有效抑制Aβ25-35所致的細胞損傷，提高細胞生存率，與模型組比較，有顯著統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）結果見表1。

表1 MTT檢測不同濃度的絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞毒性的保護作用Table 1 MTT test different concentrations of luffa extract protective effects on cytotoxicity of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.2絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞抗氧化酶活性的影響

與空白組比較，20 μmol/L的Aβ25-35處理PC12細胞后，細胞內CAT、GSH-PX活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，絲瓜提取物各劑量組可顯著增加CAT、GSH-PX活性（P＜0.01，0.05）。且具有一定的劑量相關性，見表2。

表2絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞中CAT、GSH-PX的影響Table 2 Effect of luffa extract on CAT，GSH-PX of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.3絲瓜提取物對Aβ25－35誘導PC12細胞Bcl-2和Bax表達變化的影響

與空白組比較，20 μmol/L的Aβ25-35處理PC12細胞模型組，Bax表達明顯升高（P＜0.01），Bcl-2表達明顯降低（P＜0.01），Bcl-2/Bax表達比下降；與模型組比較，絲瓜提取物高、中、低劑量組Bax表達明顯降低（P＜0.01），Bcl-2表達明顯升高（P＜0.01），Bcl-2/Bax表達水平的比值與模型組比較明顯上升。見表3和圖1。

表3絲瓜提取物對Aβ25－35誘導PC12細胞Bcl-2和Bax表達變化的影響Table 3 Effect of luffa extract on expression changes of Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25－35

1.空白組；2.模型組；3.LE低劑量組；4.LE中劑量組；5.LE高劑量組。圖1絲瓜提取物對Aβ25－35引起的相關蛋白表達的影響Fig.1 Effect of luffa extract on protein expression induced by Aβ25-35

3　結論

近年來研究表明，人體隨年齡增長所發生的退行性變化是細胞正常代謝過程中所產生的過量自由基副作用的結果。如果機體CAT、GSH-PX等抗氧化酶等減少，將導致體內自由基生成增加，加強過氧化反應，使組織和細胞受到破壞，從而使組織功能下降，引起生物體衰老。本研究表明Aβ25-35引起PC12細胞內CAT、GSH-PX等酶水平的降低，而PC12細胞經絲瓜提取物預處理后，能明顯提高Aβ25－35抑制誘導的細胞內CAT、GSH-PX酶的水平，從而降低細胞內的氧化應激水平。減輕或阻斷脂質過氧化物作用，保護機體免受過氧化氫物的損害，延緩細胞的衰老損傷，從而預防自由基導致的疾病的發生[4-5]。

Bcl家族中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的平衡對細胞是否進入凋亡通路起著重要的作用，即Bc1-2/Bax的比值決定了細胞是否發生凋亡[6-7]。試驗結果顯示，模型組Bc1-2蛋白表達反應性降低，Bax表達增強，Bc1-2/Bax的比值下降，促進細胞凋亡的發生。經絲瓜提取物干預后，Bcl-2表達增強，Bax表達減弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制細胞凋亡，表明絲瓜提取物可抑制細胞凋亡。絲瓜提取物對AD小鼠腦神細胞的保護作用，可能是通過上調Bcl-2蛋白、下調Bax蛋白的表達，抑制細胞凋亡而實現，從而達到改善老年性癡呆的作用。

綜上，絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷有著明顯的保護作用，可能是通過增強PC12細胞的抗氧化應激和抗凋亡作用，但其防治AD的機制還有待于進一步的研究。

參考文獻：

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[7]劉玲,王淑英.芍藥苷對Aβ25-35誘導PC12細胞氧化損傷的影響[J].中國中藥雜志,2013,38(9):1318-1322

The Protective Effect of Luffa Extract on Injury of PC12 Cells Induced by Aβ25-35

LIU Chun-jie，DONG Li-min，ZHENG Ya-ping，KANG Hong-yu
（Luohe Medical College，Luohe 462000，Henan，China）

Abstract：To study the protective effect of luffa extract on injury of PC12 cells induced by amyloid β protein （Aβ25-35）. Neurons injury model was induced by Aβ25-35. MTT assay was used to detect the cellular viability after different concentrations of luffa extract. The activity of catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were detected. The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blotting. Compared with the control group，the cellular viability of luffa extract group was increased，the activity of GSH -Px and CAT were significantly increased（P<0.01，P<0.05），the expression of Bax was decreased and Bcl-2 was increased（P< 0.05-P<0.01）. luffa extract can protect PC12 cells from Aβ25-35induced cytotoxicity.

Key words：luffa extract；PC12 cells；MTT assay；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.006

作者簡介：劉春杰（1971—），女（漢），副教授，研究生，研究方向：老年病及內分泌藥理。

基金項目：河南省骨干教師資助課題（2011GGJS-281）；漯河醫學高等專科學校校級科研課題（2014-S-LMC04）