苦蕎多糖抗氧化及對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖抑制作用

李?yuàn)檴?，崔曉東，李晨，李玉英，王轉(zhuǎn)花（化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

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苦蕎多糖抗氧化及對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖抑制作用

李?yuàn)檴?，崔曉東，李晨，李玉英，王轉(zhuǎn)花*
（化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

摘要：采用熱提取和Superdex G75分子排阻層析對(duì)苦蕎多糖進(jìn)行了提取及初步的分離純化，通過紫外光譜掃描和聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法鑒定多糖的純度；純化的苦蕎多糖在體外檢測(cè)其抗氧化能力及對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖抑制作用。結(jié)果表明，制備的多糖純度較高，不含核酸和蛋白質(zhì)。用純化的苦蕎多糖在體外檢測(cè)其抗氧化能力及其對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖和細(xì)胞核的影響。結(jié)果表明，該多糖對(duì)羥基自由基有明顯的清除作用，清除作用與濃度有一定的量效關(guān)系，EC50為0.17mg/mL，對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并可使細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)聚縮，染色質(zhì)DNA出現(xiàn)斷裂?？嗍w多糖的制備及其體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖等初步研究為深入考察其生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苦蕎；多糖；抗腫瘤；羥自由基

多糖（polysaccharide）是由多個(gè)單糖分子縮合經(jīng)糖苷鍵連接而成的一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且分子量龐大的聚糖類物質(zhì)。多糖及其復(fù)合物在高等動(dòng)植物的細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁中含量非常豐富，對(duì)維持生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。近年來，由于天然多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)天然多糖的研究及開發(fā)呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)[1]。近期研究表明，多種不同來源的多糖具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。蘆薈多糖能激活巨噬細(xì)胞，增加一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)進(jìn)而增加NO的合成，刺激巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤的活性[2]。枸杞多糖可提高H22荷瘤小鼠的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和人體自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）活性，同時(shí)顯著提高SOD含量降低MDA含量，表明枸杞多糖的抗腫瘤機(jī)制可能與其增強(qiáng)機(jī)體免疫力和提高機(jī)體的抗氧化活性有關(guān)[3]。銀耳中的酸性多糖能提高機(jī)體免疫力，且具有抗腫瘤作用[4]。此外，鐵筷子，南瓜，銀杏等其它的植物多糖也具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)[5-6]。

蕎麥為蓼科蕎麥屬植物，營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值較高，是一種古老的藥食同源性植物[7]。蕎麥，尤其苦蕎麥，含有豐富的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖，降血脂、防止DNA損傷等多種生理功能[8]，對(duì)糖尿病、高血脂、冠心病、中風(fēng)等病癥有一定的預(yù)防作用，逐漸引起人們的關(guān)注。作為蕎麥中主要功能物質(zhì)的多糖能顯著地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，但是蕎麥多糖抑制腫瘤增殖的報(bào)道較少，僅見于臺(tái)灣學(xué)者報(bào)道蕎麥多糖可通過誘導(dǎo)人THP-1白血病細(xì)胞分化從而抑制其增殖[9]。

為了拓寬藥食同源作物-蕎麥的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究范圍，揭示蕎麥多糖在抗病、抗衰老及其抑制腫瘤細(xì)胞的增殖等方面的作用，本試驗(yàn)以山西黑苦蕎為原料，采用熱提取和Superdex G 75分子排阻層析對(duì)苦蕎多糖進(jìn)行了提取及初步分離純化，并采用分子排阻層析對(duì)獲得的粗品進(jìn)行純化，初步研究了苦蕎麥多糖在體外對(duì)·OH自由基的清除作用及抗腫瘤效應(yīng)，為蕎麥功能性保健食品的開發(fā)研究提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

山西黑苦蕎：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供；人肝癌細(xì)胞株Hep G2：中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源中心；胰蛋白酶（trypsin）、二甲基亞砜（DMSO）：Solarbio公司；DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone；胎牛血清：杭州四季青公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；AKTA explorer蛋白純化系統(tǒng)：美國(guó)GE公司；FV1000激光共聚焦顯微鏡：日本OLYMPUS公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1苦蕎多糖的提取和純化

將苦蕎種子粉碎，去殼，過40目篩，得到苦蕎粉。經(jīng)丙酮浸泡、脫脂，除去色素、小分子糖等物質(zhì)，殘?jiān)栏蓚溆?。稱取20 g脫脂苦蕎粉，加入500 mL去離子水，90℃提取4 h，離心取上清。將沉淀再次加入去離子水，重復(fù)上述提取步驟。合并兩次提取的上清液，對(duì)上清進(jìn)行減壓濃縮至體積約100 mL，加入4倍體積95 %乙醇，4℃過夜沉淀。離心取沉淀，用少量水溶解。將溶解的沉淀用Sevag法除蛋白[10]，重復(fù)3次，冷凍干燥后得到苦蕎粗多糖。準(zhǔn)確稱取1 mg多糖粗品，加入1 mL去離子水，充分溶解后取0.5 mL上樣到Superdex G 75 HR 10/300凝膠柱，以10 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，控制流速為0.5 mL/min，280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)多糖樣品中蛋白的含量。同時(shí)將樣品收集到不同的EP管中，每管收集1 mL，用苯酚硫酸法測(cè)定多糖的含量，跟蹤多糖含量的變化。

1.3.2多糖的純度測(cè)定

取適量凝膠層析后的苦蕎多糖溶液采用紫外掃描法在200 nm~500 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外光譜掃描，檢測(cè)其在260 nm及280 nm處的吸收情況，從而判定多糖的純度。同時(shí)采用SDS-PAGE法檢測(cè)蛋白質(zhì)的殘留量。以標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白為對(duì)照，在4 %濃縮膠和12.5 %分離膠中電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.3苦蕎多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用

采用水楊酸氧化法[11]，分別加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇和不同濃度的待測(cè)液各1 mL，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)0.5 h后，分別測(cè)定對(duì)照組和樣品組在510 nm處的吸光度。按以下公式計(jì)算清除率。

式中：E為清除率，%；A0為對(duì)照組光吸收值；AX為樣品組光吸收值；AX0為空白組光吸收值。

1.3.4苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖的影響

人肝癌細(xì)胞株Hep G2，在DMEM完全培養(yǎng)基（10 %胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），37℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期Hep G2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)過夜培養(yǎng)。次日分別加入不同濃度（25、50、100、200 μg/mL）苦蕎多糖，每組各設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以加培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)組作空白對(duì)照，分別培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中培養(yǎng)液及MTT，每孔加入150 μL DMSO，室溫低速振蕩10 min。待結(jié)晶物完全溶解后，在酶標(biāo)免疫測(cè)定儀（BIO-RAD MODEL 550）測(cè)定490 nm處的吸光值。

1.3.5苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞細(xì)胞核的影響

將無菌的蓋玻片鋪于6孔板底部，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞適量接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜至細(xì)胞貼壁，用200 μg/mL的苦蕎多糖，分別作用Hep G2細(xì)胞24 h和48 h，DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察Hep G2細(xì)胞核形態(tài)的變化。將同樣條件作用后的Hep G2細(xì)胞提取DNA[12]，2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段化。

2結(jié)果與分析

2.1苦蕎多糖的分離純化

按照1.3.1方法，以1∶25（g/mL）的料液比，在溫度為90℃，提取4 h后，通過Sevag法除去游離蛋白質(zhì)，獲得多糖粗提物。苦蕎多糖的純化及鑒定如圖1所示。

A.苦蕎粗多糖在Superdex G 75凝膠柱的分離；B.多糖的純度鑒定；Mr.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1.純化的苦蕎麥多糖。圖1苦蕎多糖的純化及鑒定Fig.1 Purification and identification of TBL

粗多糖經(jīng)Superdex G75凝膠層析進(jìn)行了初步的分離純化，苯酚-硫酸法測(cè)定的結(jié)果顯示（圖1A），在洗脫體積為8 mL~15 mL時(shí)，為多糖的吸收峰。根據(jù)多糖出峰位置判定，該提取物分子量約為20 kD~50 kD，因此我們推測(cè)獲得的蕎麥多糖可能為一種復(fù)合多糖。紫外掃描法結(jié)果顯示，制備的多糖在280 nm處沒有明顯的吸收，同時(shí)SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果（圖1B）也表明，制備的多糖不含蛋白，純度較高。

2.2苦蕎多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

羥自由基是體內(nèi)最活躍的活性氧，可導(dǎo)致大量疾病的發(fā)生，對(duì)羥自由基清除率的檢測(cè)是抗氧化劑抗氧化活性檢測(cè)的指標(biāo)之一。按照1.3.3方法測(cè)定并計(jì)算純化的苦蕎多糖對(duì)羥自由基的清除作用，結(jié)果如圖2所示。

圖2多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用Fig.2 Scavenging effects of polysaccharides on hydroxyl free radical

由圖2可知，在較低濃度時(shí)（0.1mg/mL~0.3mg/mL），苦蕎多糖對(duì)羥自由基的清除作用隨著濃度升高而增強(qiáng)，有明顯的量-效關(guān)系，但當(dāng)濃度達(dá)到0.3 mg/mL或更高時(shí)，清除能力增加緩慢，經(jīng)計(jì)算可知，清除率達(dá)50 %時(shí)，所需多糖濃度EC50為0.17 mg/mL。試驗(yàn)中，以清除羥自由基能力較強(qiáng)的VC做參照，圖2顯示VC的EC50為0.03mg/mL，對(duì)羥自由基的清除率可達(dá)近100 %，苦蕎多糖最大清除率為72 %左右，表明本法提取的多糖具有一定的抗氧化能力。

2.3苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法測(cè)定了苦蕎多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。苦蕎多糖HepG2細(xì)胞增殖抑制作用如圖3所示。

圖3苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖抑制作用Fig.3 The effect of tartary buckwheat polysaccharides on Hep G2 cells proliferation

對(duì)從曲線圖（圖3）分析，苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞的抑制作用呈劑量與時(shí)間依賴性。當(dāng)不同濃度多糖（50 μg/mL~200 μg/mL）作用時(shí)間為24 h時(shí)，隨著苦蕎多糖濃度的升高，對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖抑制作用也逐漸升高。而同樣濃度的多糖作用48 h時(shí)的抑制效果明顯強(qiáng)于24 h。當(dāng)濃度為200 μg/mL，作用48 h后，苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖最大抑制率可達(dá)35 %。

2.4苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞核的影響

苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞核和DNA的影響見圖4和圖5。

A.對(duì)照組；B. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細(xì)胞24 h；C. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細(xì)胞48 h。圖4苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞細(xì)胞核的影響Fig.4 Hep G2 Cells nuclei morphological changes induced by tartary buckwheat polysaccharides

A.對(duì)照組；B. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細(xì)胞24 h；C. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細(xì)胞48 h。圖5苦蕎多糖對(duì)Hep G2細(xì)胞DNA的影響Fig.5 The effect of Tartary buckwheat polysaccharides on DNA of Hep G2 cells

苦蕎多糖作用Hep G2細(xì)胞24 h和48 h后，經(jīng)DAPI染色，圖4顯示，細(xì)胞核都出現(xiàn)了不同程度的濃縮及典型細(xì)胞凋亡的特征，且作用48 h時(shí)，核異化率明顯高于24 h。另外，用苦蕎多糖作用Hep G2細(xì)胞不同時(shí)間后，檢測(cè)DNA的變化，圖5顯示，苦蕎多糖可使染色質(zhì)DNA出現(xiàn)斷裂，產(chǎn)生大小不等的DNA片段，但未出現(xiàn)典型的200整數(shù)倍的DNA ladder條帶。有關(guān)苦蕎多糖抑制Hep G2細(xì)胞增殖的機(jī)理還有待深入研究。

3討論與結(jié)論

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)，分子中的單糖又可以在不同的位點(diǎn)相互連接形成不同的支鏈或者直鏈結(jié)構(gòu)。與其它天然產(chǎn)物類似，目前很難得到純多糖或分子量不變的多糖，同時(shí)多糖的純度和分子量和藥效有很大關(guān)系[13]。不同的提取條件，如溫度、pH值的改變可能會(huì)破壞植物多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，引起多糖鏈降解，從而導(dǎo)致植物多糖某種活性的失活。因此研究蕎麥多糖的提取條件與相應(yīng)生物活性的關(guān)系有利于多糖在食品、醫(yī)療和保健領(lǐng)域的應(yīng)用。

多糖的抗腫瘤作用機(jī)制可以歸納為兩大類：第一類多糖與機(jī)體的免疫細(xì)胞通過分子間的接觸，激活免疫細(xì)胞，釋放出某種信號(hào)分子，進(jìn)而激發(fā)和增強(qiáng)免疫反應(yīng)，間接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞。例如，從植物、細(xì)菌和真菌中提取到β-葡聚糖，使免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、T 和B淋巴細(xì)胞及其它效應(yīng)細(xì)胞）迅速處于激活狀態(tài)，誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制腫瘤或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖[14]。另一類多糖是具有細(xì)胞毒性的多糖，可以直接殺死腫瘤細(xì)胞，如青錢柳多糖可以顯著抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘使細(xì)胞發(fā)生凋亡，使細(xì)胞在S期發(fā)生阻滯[15]。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，苦蕎多糖可以使Hep G2細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)凝集等凋亡特征，并且出現(xiàn)明顯的DNA斷裂等現(xiàn)象，與Wu等[9]報(bào)道存在較大的差異，分析原因可能是二者多糖來源及種類不同，前者來源于普通蕎麥，后者來源于苦蕎麥。同時(shí)二者在提取方法上也存在較大的差異，這也可能是二者多糖出現(xiàn)功能差異的原因之一。這些基礎(chǔ)研究也將為深入研究天然生物活性物質(zhì)的功能，為功能保健食產(chǎn)品的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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Antioxidant Activity and Anti-cancer Efficacy on Hep G2 Cells of Polysaccharide from Tartary Buckwheat Seeds

LI Shan-shan，CUI Xiao-dong，LI Chen，LI Yu-ying，WANG Zhuan-hua*
（Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education，Institute of Biotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，Shanxi，China）

Abstract：Tartary buckwheat polysaccharides were isolated by heat extraction and molecular exclusion chromatography，and purity was carried out by UV-visible absorption spectra and SDS-PAGE. The antioxidant activity was evaluated by·OH free scavenging assay. At the same time，anti-cancer efficacy of tartary buckwheat polysaccharides was evaluated. The results showed that the purified polysaccharides contained neither protein nor nucleic acids and had obvious hydroxyl free radical scavenging effect，with an EC50of 0.17 mg/mL. Tartary buckwheat polysaccharides could significantly inhibit the Hep G2 cells proliferation. Moreover，the DNA break of Hep G2 cells occurred after treated with tartary buckwheat polysaccharides. The preparation and the function study of buckwheat polysaccharide have paved the way for the comprehensive research of its biological activity.

Key words：tartary buckwheat；polysaccharide；antitumour；hydroxyl radicals

收稿日期：2014-07-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.003

*通信作者：王轉(zhuǎn)花（1956—），女，教授，博導(dǎo)，研究方向：蛋白質(zhì)與生物活性物質(zhì)。

作者簡(jiǎn)介：李?yuàn)檴櫍?990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)與生物活性物質(zhì)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然/青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31171659/31300653）；山西省科技項(xiàng)目（2014091028）