香豆素類(lèi)化合物清除自由基及抗腫瘤活性研究

張娜，陳文娟，柳青青，周玥，鐘儒剛（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124）

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香豆素類(lèi)化合物清除自由基及抗腫瘤活性研究

張娜，陳文娟，柳青青，周玥，鐘儒剛
（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124）

摘要：運(yùn)用電子順磁共振（EPR）和細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（MTS）兩種方法研究4個(gè)雙羥基香豆素化合物及天然產(chǎn)物VC的清除DPPH自由基及抗腫瘤細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果表明，香豆素化合物清除DPPH自由基EC50值和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性IC50值的范圍分別為9.04 μmol/L~37.32 μmol/L和21.76 μmol/L~38.48 μmol/L，均優(yōu)于VC自由基清除能力（EC50為42.44μmol/L）和抗腫瘤細(xì)胞增殖能力（IC50為>100 μmol/L）。其中，化合物1a的清除自由能力最強(qiáng)（EC50為9.04 μmol/L），化合物2b的抗腫瘤活性最高（IC50為21.76 μmol/L）。因此，與VC相比，4個(gè)雙羥基類(lèi)化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，為具有癌癥防治功能的天然產(chǎn)物抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：香豆素；自由基清除能力；抗腫瘤活性；EPR；MTS

癌癥是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命的最主要的疾病之一，而人體內(nèi)過(guò)量的自由基可導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官的損傷，進(jìn)而誘發(fā)癌癥及心血管功能障礙等多種疾病[1-2]，攝入外源性的抗氧化劑可以在生理上和藥理水平上有效降低或預(yù)防癌癥的發(fā)生[3]。研究表明，作為抗氧化劑的天然產(chǎn)物如白藜蘆醇、大豆異黃酮和黃芩素可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡[4]。因此，兼具自由基清除活性且抗腫瘤活性的抗氧化劑成為癌癥防治的重要來(lái)源。

香豆素是一類(lèi)廣泛分布于傘形科和蕓香科植物中的苯并呲喃酮衍生物，具有抗菌、消炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[5]，已被認(rèn)定為重要的藥物先導(dǎo)化合物。相關(guān)文獻(xiàn)表明，香豆素類(lèi)化合物通過(guò)控制血糖和血脂，抑制過(guò)氧自由基功效，抑制脂氧合酶和環(huán)氧合酶花生四烯酸的代謝途徑而發(fā)揮其抗氧化性功效[6-7]；同時(shí)，該類(lèi)化合物在體內(nèi)是一類(lèi)重要的抗癌物質(zhì)，對(duì)人類(lèi)肺癌，腎癌及乳腺癌細(xì)胞線(xiàn)粒體具有顯著的抗增殖活性，也可通過(guò)抑制細(xì)胞中Cyclin D1的過(guò)量表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞增殖[8]。因此，香豆素所具有的多種藥理作用，如神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗炎作用等均與其抗氧化活性有關(guān)[9-10]。本研究選擇4-甲基及4-三氟甲基取代的雙羥基香豆素類(lèi)化合物（如圖1所示），分別是來(lái)源于木犀科植物苦櫪白蠟樹(shù)的七葉亭（6，7-二羥基香豆素），及瑞香屬植物長(zhǎng)白瑞香的瑞香素（7，8-二羥基香豆素）的衍生物，采用電子順磁共振方法（EPR）及細(xì)胞增殖試劑盒（MTS）測(cè)定化合物清除DPPH自由基的能力及抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，以探究?jī)深?lèi)化合物的清除自由基能力及抗腫瘤活性，為具有癌癥防治功能的天然產(chǎn)物抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

圖1香豆素化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of coumarins

1材料與方法

1.1材料與儀器

6，7-二羥基-4-甲基香豆素（1a）、7，8-二羥基-4-甲基香豆素（1b）：百靈威公司；6，7-二羥基-4-三氟甲基香豆素（2a）、7，8-二羥基-4-三氟甲基香豆素（2b）：以1，2，4-苯三酚，1，2，3-苯三酚及三氟乙酰乙酸乙酯為原料：北京工業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心自制[11]；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）：美國(guó)Sigma公司；無(wú)水甲醇（一級(jí)色譜純）：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；MTS試劑盒：北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株：上海華瑞生物科技有限公司。

A-300電子順磁共振儀：德國(guó)Bruker公司；EnSpire酶標(biāo)儀：美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2方法

1.2.1化合物溶液配置

香豆素溶液配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0096g化合物1a 與1b和0.0123g化合物2a與2b，使用無(wú)水甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成濃度為1 mmol/L儲(chǔ)備液。

VC溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.008 8 g VC，使用去離子水溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成濃度為1 mmol/L儲(chǔ)備液。使用去離子水將溶液稀釋為20、40、60、80、100、120、140 μmol/L的使用液。

DPPH溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH固體粉末0.071 0 g，用無(wú)水甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶，配制成1.80 mmol/L DPPH儲(chǔ)備液，冷藏避光保存。準(zhǔn)確移取5 mL儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶，用無(wú)水甲醇定容至刻度，配制成0.180 mmol/L DPPH使用液，使用液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

使用無(wú)水甲醇將1 mmol/L儲(chǔ)備液稀釋為0、5、10、20、40、60、80、100 μmol/L的使用液。取不同濃度的香豆素化合物按照表1進(jìn)行加樣，反應(yīng)30 min后用50 μL毛細(xì)管吸取一定量反應(yīng)混合液裝入保護(hù)管，置于諧振腔中進(jìn)行測(cè)試[12]。EPR儀器所采用的參數(shù)為：中心磁場(chǎng)3 524.970 G；掃場(chǎng)寬度200.000 G；微波頻率9.842 GHz；微波功率20.17 mW；調(diào)制頻100 kHz；調(diào)制幅度2.00 G。以譜圖中3 507 G處峰高表示DPPH自由基的強(qiáng)度，按公式1計(jì)算化合物對(duì)DPPH自由基的清除率。

表1 EPR試驗(yàn)加樣表Table 1 Sample composition for EPR experiment

式中：I1為未加化合物時(shí)DPPH原始信號(hào)強(qiáng)度，使用無(wú)水甲醇代替樣品液；I2為加入化合物后DPPH的信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.3抗腫瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)定

使用RPMI1640培養(yǎng)基將1 mmol/L儲(chǔ)備液稀釋為10、20、40、60、80、100、120、240 μmol/L的待測(cè)液。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，以每孔7 500個(gè)細(xì)胞的量接種到96孔板內(nèi)。在37℃，5 % CO2條件下孵育培養(yǎng)24 h，設(shè)置陰性對(duì)照3孔，將含有不同濃度的香豆素化合物的待測(cè)液處理A549細(xì)胞24 h。藥物作用24 h后，每孔加入10 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，終止培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，并按公式2計(jì)算化合物對(duì)肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制率繪制曲線(xiàn)。

式中：D1為未加待測(cè)物時(shí)的OD值，使用培養(yǎng)基代替樣品液；D2為加入待測(cè)物時(shí)的OD值。

2結(jié)果與分析

2.1香豆素化合物及VC清除DPPH自由基的能力

運(yùn)用EPR方法對(duì)不同濃度的化合物及VC進(jìn)行測(cè)試。以磁場(chǎng)強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制化合物清除DPPH自由基的電子順磁共振波譜圖。以化合物1a和VC為例，如圖2所示。

圖2不同濃度的化合物1a及VC清除DPPH自由基的電子順磁共振波譜圖Fig.2 EPR signals of DPPH radicals scavenging for the different concentrations of compound 1a and VC

由圖2可知，DPPH自由基特征峰中心磁場(chǎng)均在3 507 G，自由基波譜信號(hào)強(qiáng)度均隨化合物濃度的增加而顯著減小，說(shuō)明化合物的濃度越大對(duì)DPPH自由基的清除作用越強(qiáng)。進(jìn)一步分析可知，化合物1a在濃度大于20 μmol/L后信號(hào)銳減，濃度為60 μmol/L時(shí)信號(hào)強(qiáng)度趨于零，說(shuō)明化合物1a對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)。

香豆素化合物的清除自由基能力通過(guò)自由基清除率的EC50值體現(xiàn)，EC50值越小，則清除能力越高。以DPPH自由基清除率（%）對(duì)化合物濃度（μmol/L）作圖，見(jiàn)圖3。

圖3香豆素化合物及VC對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度關(guān)系Fig.3 The correlation between DPPH radical scavenging rate and concentrations of coumarins and VC

由圖3可知，在一定濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨濃度化合物的增加而逐漸升高。化合物1a與化合物1b，2a，2b分別在0~20 μmol/L和0~40 μmol/L內(nèi)，清除率顯著升高，60 μmol/L的化合物1a與 80 μmol/L的化合物1b，2a，2b自由基清除效果相當(dāng)，且清除率接近100 %。這與波譜圖的變化趨勢(shì)是一致的。結(jié)果通過(guò)計(jì)算得出：4種香豆素化合物（1a、1b、2a、2b）及VC清除DPPH自由基的EC50值（DPPH起始強(qiáng)度減少50 %時(shí)所對(duì)應(yīng)的清除劑濃度）分別為：9.04、37.32、34.60、29.33、42.44 μmol/L，清除能力依次為：化合物1a> 2b> 2a> 1b>VC。說(shuō)明4種香豆素類(lèi)化合物清除DPPH自由基的能力優(yōu)于天然抗氧化劑VC。

2.2香豆素化合物及VC抑制A549細(xì)胞的增殖能力

運(yùn)用MTS方法，對(duì)不同濃度的4個(gè)化合物及VC進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞A549增殖活性測(cè)試。以增殖抑制率（%）對(duì)化合物濃度（μmol/L）作圖，見(jiàn)圖4。

圖4化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞A549增殖的抑制率與濃度的關(guān)系Fig.4 The correlation between A549 cell proliferation inhibitory rate and concentrations of coumarins

由圖4可知，不同的香豆素衍生物作用于A549細(xì)胞24 h后，對(duì)A549細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，且隨著香豆素衍生物濃度的增加，其增殖抑制率也在逐漸上升，說(shuō)明化合物的濃度越大對(duì)A549細(xì)胞的增值抑制能力越強(qiáng)。進(jìn)一步分析可知，不同化合物對(duì)A549細(xì)胞的抗增殖作用隨濃度變化趨勢(shì)不同，化合物1a、1b、2a的濃度到達(dá)100 μmol/L時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞抗增值作用已經(jīng)接近于80 %且趨于平緩；而只有化合物2b濃度為80 μmol/L/時(shí)其抑制率已經(jīng)超過(guò)80 %，故化合物2b具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞的作用。

香豆素化合物的抗腫瘤活性可通過(guò)增值抑制率的IC50值體現(xiàn)，抗腫瘤活性越高，IC50值越小。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：4種香豆素化合物（1a、1b、2a、2b）的抗腫瘤活性分別為：38.48、33.53、31.66、21.76 μmol/L；而VC的抗腫瘤活性>100 μmol/L，這與已報(bào)到的文獻(xiàn)相一致[13-14]。抗腫瘤活性的強(qiáng)弱依次為：化合物2b> 2a> 1b> 1a>VC；同時(shí)，吸電子基團(tuán)CF3取代香豆素衍生物抗腫瘤細(xì)胞增值活性?xún)?yōu)于CH3取代香豆素衍生物。

3　結(jié)論

運(yùn)用電子順磁共振和MTS兩種方法分別對(duì)香豆素化合物的自由基清除能力及抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，雙羥基香豆素類(lèi)化合物不僅對(duì)DPPH自由基具有較好的清除能力，而且對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的抑制活性，且均與香豆素的濃度呈正相關(guān)性。此試驗(yàn)中的香豆素化合物清除DPPH自由基能力及抗腫瘤細(xì)胞增殖活性均優(yōu)于VC，其中自由基清除能力最強(qiáng)為化合物1a（EC50=9.04 μmol/L），抗腫瘤活性最好的是化合物2b（IC50=21.76 μmol/L），該研究為具有癌癥防治功能的天然產(chǎn)物抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

總之，從天然植物中尋找天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，具有治療作用的天然抗氧化劑也將是現(xiàn)代醫(yī)藥、保健行業(yè)的發(fā)展方向。因此，基于天然植物，篩選和開(kāi)發(fā)抗氧化作用確切、安全無(wú)毒的新品種或分離提取其有效抗氧化成分，并針對(duì)其抗氧化機(jī)理、協(xié)同作用、構(gòu)效關(guān)系和分子設(shè)計(jì)等方面開(kāi)展深入研究，將為天然抗氧化劑的應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)思路。

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Studies on Radical Scavenging and Anti-tumor Effects of Coumarins

ZHANG Na，CEHN Wen-juan，LIU Qing-qing，ZHOU Yue，ZHONG Ru-gang
（College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China）

Abstract：The free radical DPPH scavenging and anti-tumor activity of four dihydroxy coumarin derivatives and VCwere investigated using electron paramagnetic resonance（EPR）and MTS methods. The results showed that the ranges of EC50（radical scavenging ability）and IC50（antitumor activity）values of four compounds were 9.04 μmol/L-37.32 μmol/L and 21.76 μmol/L-38.48 μmol/L，respectively，and therefore the radical scavenging and anti-tumor ability of four compounds were more potential than those of VCwith EC50=42.44 μmol/L and IC50>100 μmol/L，respectively. Compound 1a（EC50=9.04 μmol/L）and 2b（IC50=21.76 μmol/L）were the most active compounds at DDPH radical scavenging and antitumor，respectively. In conclusion，compared with VC，four coumarin compounds exhibited more potential ability at radical scavenging and antitumor cell proliferation，and were considered as the natural antioxidant with free radical scavenging abilityand antitumor activity.

Key words：coumarins；radical scavenging ability；antitumor activity；EPR；MTS

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.001

作者簡(jiǎn)介：張娜（1981—），女（漢），助理研究員，博士，研究方向：天然抗氧化劑研究與開(kāi)發(fā)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81402852）；北京市自然科學(xué)基金（7152013）；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃（KM201610005031）