楊樹螢葉甲DNA條形碼研究

席歐彥,李 曉,鄭 飛,段新晨,唐秀麗,胡紅英

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

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楊樹螢葉甲DNA條形碼研究

席歐彥,李 曉,鄭 飛,段新晨,唐秀麗,胡紅英

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

摘要：【目的】楊樹螢葉甲(楊毛臀螢葉甲)(Agelastica alni orientalis Baly)主要分布于新疆，是楊、柳及蘋果等林果的重要食葉害蟲，對作物的嚴重危害期通常在幼蟲期，難以對此做出準確鑒定。運用DNA條形碼技術可以對害蟲各齡期的標本進行快速和準確的鑒定。【方法】通過提取楊樹螢葉甲的基因組DNA，以線粒體細胞色素氧化酶(COⅠ)基因作為通用引物進行PCR擴增，最后獲得準確的堿基序列作為楊樹螢葉甲的DNA條形碼。【結果】根據楊樹螢葉甲在不同齡期的DNA序列一致的原理，運用DNA條形碼研究技術，獲得了楊樹螢葉甲成蟲和三齡幼蟲的COⅠ基因序列，并進行了序列分析。結果顯示相似性最高可達97.74%。獲得的序列可以用于對楊樹螢葉甲的祿步鑒定。【結論】DNA條形碼技術可簡單、快速、準確的鑒定不同齡期楊樹螢葉甲的標本，為及時采取害蟲防治措施提供基礎數據。

關鍵詞：楊樹螢葉甲； DNA條形碼；COⅠ基因；快速鑒定

0 引 言

【研究意義】楊樹螢葉甲又名楊毛臀螢葉甲(AgelasticaalniorientalisBaly)，屬鞘翅目(Coleoptera),葉甲科(Chrysomelidae)。在國內主要分布于新疆和內蒙古，在新疆境內自烏魯木齊起，西到伊犁，北迄塔城，東抵托克遜、哈密，南自和田、喀什等地。它是新疆危害楊、柳、榆、巴旦杏、蘋果樹的主要食葉害蟲。近幾年在烏魯木齊、昌吉和伊犁等地區的苗圃、防護林及果園為害猖獗。主要以成蟲和幼蟲為害，該蟲蟲口密度較大，取食量大，成蟲取食柳葉部分的葉肉和葉脈，留下缺刻；其幼蟲從柳葉背面取食柳葉的葉肉、剩下葉脈，被食害的柳葉呈網狀缺刻，大大降低了柳葉的光合作用，導致柳葉枯黃、早落。嚴重時整棵柳樹只剩下樹干，它不僅危害柳樹還危害楊樹、榆樹、蘋果樹等，嚴重影響了林木及果樹的生長。而且它是五種柳樹食葉害蟲中危害情況最嚴重的害蟲[1-2]。而目前對該害蟲的鑒定主要根據其形態特征，對危害嚴重的害蟲鑒定較為困難。DNA條形碼不受發育階段的影響，可為快速準確的鑒定該害蟲的幼蟲期提供重要依據。【前人研究進展】DNA條形碼(DNA barcoding)是由加拿大Hebert等首次正式提出，是應用有足夠變異的標準化短基因片段對物種進行快速、 準確鑒定的新的生物身份識別系統。具有準確性高、鑒定快速、且不受發育階段的影響等優點[3]。隨著DNA條形碼技術的推進,已經發布的DNA條形碼序列有168 719種,其中完整的物種DNA條形碼序列 (包含準確的物種信息和條形碼序列信息 )19 163個物種[4]。很多國際組織自行建立的 DNA條形碼數據庫構成整個DNA條形碼項目的重要組成部分，比如，Birds組織計劃在5年內完成所有鳥類約10 000種的DNA條形碼數據庫的構建,1 233種鳥類的DNA條形碼數據已經得到[5]。近年來在國內昆蟲條形碼研究也在不斷進行，主要是關于鞘翅目(Coleoptera)、直翅目(Orthoptera)、半翅目(Hemiptera)、鱗翅目(Lepidoptera)的天蛾和卷蛾、雙翅目(Diptera)實蠅與寄蠅、膜翅目中國榕小蜂的相關研究進展。DNA 條形碼作為當代生命科學領域最為活躍的學科之一受到重視。在全球已知鞘翅目種類36×104余種，占全球已知昆蟲總數的1/3，中國記載約1×104余種。鞘翅目昆蟲數量眾多，國內外學者對鞘翅目不同分類階元的系統發育問題進行了廣泛而深入的研究。國內研究方面利用線粒體基因部分序列對鞘翅目昆蟲系統發育關系的研究較多，對DNA條形碼的研究并不是很多。到目前為止( 2014年2 月) ，GenBank 上共提交鞘翅目線粒體全基因組( 或者近線粒體全基因組) 共74個，而針對楊樹螢葉甲的全基因組序列測定的則沒有[6-10]。【本研究切入點】目前對楊樹螢葉甲幼蟲的形態學鑒定較為困難，而DNA條形碼技術能快速鑒定各齡期昆蟲。因而研究基于楊樹螢葉甲DNA條形碼缺少的情況，選擇昆蟲條形碼通用基因線粒體DNA[11]，對不同齡期的楊樹螢葉甲的COⅠ基因進行擴增、測序，為其快速、準確鑒定提供科學依據。因此，利用線粒體DNA來測出楊樹螢葉甲的序列對快速的鑒定楊樹螢葉甲有很重要的意義。【擬解決的關鍵問題】DNA barcoding 的技術流程比較簡潔，主要包括樣品獲取、DNA提取、PCR擴增、序列測定、序列比對及根據序列差異進行判別。通過獲得準確的序列來對楊樹螢葉甲進行快速的鑒定，以便為及時采取害蟲防治措施提供基礎數據，為自治區農林業的發展作出貢獻[12]。

1材料與方法

1.1　材 料

在新疆大學和新疆醫科大學等校園內柳樹上捕捉楊樹螢葉甲成蟲，采摘大量帶有卵塊的葉片。

1.2　 方 法

1.2.1 楊樹螢葉甲的室內飼養及形態學觀察鑒定

成蟲的飼養：將采集到的楊樹螢葉甲成蟲放在有通氣孔的小罐中，在罐中放入少量柳樹葉片,并放置在室溫(20~30℃)下，并保證光照充足。幼蟲的飼養：當一齡幼蟲孵出后，開始在培養皿中飼養，同樣放置在室溫下，保證濕度合適。

在飼養的過程中挑出一部分幼蟲分齡期保存。放置于-20℃的冰箱中凍存，以備后續實驗用。如果需要長期保存可將其放入無水乙醇中保存或者放入超低溫冰箱中凍存。

1.2.2 楊樹螢葉甲基因組DNA的提取

實驗前的材料處理。取無水乙醇中浸泡的楊樹螢葉甲的成蟲，先用蒸餾水進行沖洗，去除殘留的酒精，再將其用剪刀剪成小塊，液氮研磨。楊樹螢葉甲的幼蟲同樣先用蒸餾水沖洗，去除殘留酒精，再將幼蟲切成小塊。新鮮材料可直接用液氮研磨處理。利用通用型柱式基因組提取試劑盒(康維世紀)，按照說明書的操作步驟進行提取。

1.2.3 PCR擴增產物

分別取楊樹螢葉甲成蟲和三齡幼蟲的DNA。如果DNA濃度過高,在用之前可先稀釋，再作為模板。COI通用引物的序列[13-15]：

LCO1490 5’

—GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG—3’

HCO2198 5’

—TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA—3’

由公司合成引物(北京鼎國公司)，利用PCR儀(PCR儀2400PE，美國)進行PCR擴增。PCR擴增體系為：ddH2O，11 L；10×PCR Buffer ，2 L；MgCl2，2 L；模板，1.5 L；dNTP，2 L；Taq酶(5U/L)，0.5 L；上下游引物各0.5 L。共計20 L。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；52℃退火 50 s；72℃延伸 30 s；循環30次；最后72℃保留10 min。PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物擴增情況。

1.2.4 序列處理

將PCR擴增的產物交由公司測序，測序完成后對序列進行處理分析。使用DNAMAN進行核苷酸序列的分析，用BLAST軟件( http://www．ncbi．nlm．nih．gov /blast)進行核苷酸序列的同源性分析。

2 結果與分析

2.1　結楊樹螢葉甲的形態學鑒定

楊樹螢葉甲成蟲為橢圓形，具藍色金屬光澤，體長7.0~8.0 mm。該蟲屬于完全變態昆蟲，分為卵、幼蟲、蛹、成蟲四個階段。其中，幼蟲又有三個齡期(一齡，二齡，三齡)。圖1

注：A.卵； B.幼蟲； C.蛹； D.成蟲

Note:A. egg B. larvae C. pupa D. adult

圖1 楊樹螢葉甲的各齡期形態
Fig.1Life cycle ofAgelasticaalniorientalisBaly

2.2　 楊樹螢葉甲基因組DNA的提取結果

利用試劑盒所提取的基因組DNA，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得的DNA條帶完整，清晰無蛋白質和RNA的污染。電泳圖可知：楊樹螢葉甲成蟲和幼蟲分子量大小均為15 000 bp。圖2

M:15 000 bp ladder；1,2：幼蟲；3：成蟲

M: 15，000 bp ladder;1,2: larvae;3：adult

圖2 楊樹螢葉甲總DNA提取
Fig.2Total DNA fromAgelasticaalniorientalisBaly

2.3　 CO I基因PCR擴增后的電泳結果

將稀釋了50倍的楊樹螢葉甲成蟲和幼蟲的基因組DNA作為模板，利用通用引物對其擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，楊樹螢葉甲COI基因序列分子量為700 bp左右，與預期結果一致。圖3

注：1,2,3:幼蟲;4,5:成蟲； 6:陰性對照； M:2 000 bp ladder

Note:1, 2, 3: larvae;4,5: adult;6: negative control; M: 2，000 bp ladder

圖3楊樹螢葉甲COⅠ基因PCR產物電泳圖
Fig.3Electrophoresis ofCOⅠ gene PCR productsofAgelasticaalniorientalisBaly

2.4 　PCR測序結果

將通用引物擴增出來的楊樹螢葉甲成蟲和三齡幼蟲的PCR產物直接送公司測序，所得的測序結果如下。

楊樹螢葉甲的三齡幼蟲序列：

AGGGCGGCCATTCTTATTTTTGGTATTTGAGCAGGATAGTAGGAACATCATTAAGAATTC

TAATTCGAGTAGAATTAGGAAATCCTGGCTCATTAATTGGTAATGACCAAATTTACAATG

TAATCGTAACAGCTCATGCTTTTATCATAATTTTCTTTATAGTTATACCTATCATAATTGGA

GGATTTGGTAATTGACTTGTCCCATTAATAATTGGAGCTCCAGATATAGCATTTCCACGA

ATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCCCCATCAATTTTTTTATTAATTATAAGTAGAAT

TGTAGAAAGAGGAGCAGGGACGGGATGAACAGTATATCCTCCTTTATCTTCTAATATCG

CTCATAATGGTTCATCAGTTGATTTAGCTATTTTTAGCCTTCATTTAGCTGGAATTTCATC

TATTTTAGGTGCCATTAATTTTATTACAACAGTTATTAATATACGACCAAATGGAATAAGA

TTTGACCGAATACCCTTATTTGTCTGAGCAGTAGTAATTACTGCAGTTCTATTATTACTAT

CTTTACCAGTTTTAGCTGGTGCTATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAATACATC

ATTTTTTGATCCAACTGGTGGAGGTGACCCAATTCTATACCAACACTTATTT

楊樹螢葉甲的成蟲序列:

TTACAGAGAGGCTTTACTTTATTTTTGGTTTTGAGCAGGAATAGTAGGAACATCATTAA

GAATTCTAATTCGAGTAGAATTAGGAAATCCTGGCTCATTAATTGGTAATGACCAAATTT

ACAATGTAATCGTAACAGCTCATGCTTTTATCATAATTTTCTTTATAGTTATACCTATCATA

ATTGGAGGATTTGGTAATTGACTTGTCCCATTAATAATTGGAGCTCCAGATATAGCATTT

CCACGAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCCCCATCAATTTTTTTATTAATTATAAG

TAGAATTGTAGAAAGAGGAGCAGGGACGGGATGAACAGTATATCCTCCTTTATCTTCTA

ATATCGCTCATAATGGTTCATCAGTTGATTTAGCTATTTTTAGCCTTCATTTAGCTGGAAT

TTCATCTATTTTAGGTGCCATTAATTTTATTACAACAGTTATTAATATACGACCAAATGGA

ATAAGATTTGACCGAATACCCTTATTTGTCTGAGCAGTAGTAATTACTGCAGTTCTATTAT

TACTATCTTTACCAGTTTTAGCTGGTGCTATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAA

TACATCATTTTTTGATCCAACTGGTGGAGGTGACCCAATTCTATACCAACACTTATTT

2.5 　楊樹螢葉甲基因組的序列

將楊樹螢葉甲成蟲與三齡幼蟲的序列做初步的比對。又利用NCBI 中的“BLAST”軟件進行檢索，發現研究所獲得的基因序列的同源性很高，證明所獲得基因序列真實可信。之后在GenBank中注冊了該昆蟲的基因序列，登錄號為KP250652，可以利用此登錄號查找出基因序列。將楊樹螢葉甲的成蟲和三齡幼蟲的測序結果利用DNAMAN軟件進行分析，結果顯示相似性最高可達97.74%。楊樹螢葉甲成蟲和三齡幼蟲的堿基變化，利用DNAMAN進行序列分析，輸出多序列對比的結果所示，相比而言，楊樹螢葉甲三齡幼蟲的核苷酸序列中存在5個堿基(第1,2,3,4和41位點)的缺失(用·表示)；第7個位點,第9個位點，第13個位點,第14個位點，第16個位點，第20個位點和第21個位點的堿基出現不同。圖4

3 討 論

DNA barcoding提出后就存在許多爭議。目前主要集中在以下兩個方面:一是DNA barcoding技術與傳統分類學的關系；二是關于DNA barcoding的一些技術問題。隨著DNA條形碼技術研究的不斷推進，DNA條形碼技術有巨大的潛力能夠廣泛的進行科學應用,在保護生物學,包括生物多樣性調查等領域尤其顯著。當傳統的分類學受到阻礙時,這種技術就更可以發揮其優勢。另外，利用DNA條形碼技術為分類學家發現新種提供了一個新方法[16]。

目前，由于楊樹螢葉甲在我國分布有局限性，研究的還比較少，在文獻中關于楊樹螢葉甲DNA條形碼的報道也幾乎沒有，而在新疆楊樹螢葉甲對林果業的危害很大，DNA條形碼的研究是很有必要的，也具有一定的創新性和研究價值。如果條形碼可以在鑒定和檢驗上得到充分的利用，就會為新疆林果業害蟲的防治帶來新的生機。因此，利用分子生物學的方法對楊樹螢葉甲分類和鑒定，且有快速有效，不受齡期限制的特點，可用于楊樹螢葉甲的準確快速鑒定。其中存在的問題有:(1)取材:材料主要依賴野外采集，而且昆蟲發生期間時間集中、短暫，很大程度上受季節的影響；(2)保存： 根據文獻，將新鮮的材料保存在無水乙醇中，實際提取過程中，發現楊樹螢葉甲總DNA有降解的現象，導致實驗結果不甚理想。還可以再繼續對楊樹螢葉甲的蛹，一齡、二齡幼蟲的序列繼續測定，再做進一步的序列比對。通過對楊樹螢葉甲的成蟲和三齡幼蟲所提取的總DNA經電泳檢測，所得的DNA條帶完整，清晰無蛋白質和RNA的污染。由于楊樹螢葉甲幼蟲在保存過程中方法有些不當，DNA有些降解現象，但純度足夠高不影響后續的實驗。PCR擴增后，將稀釋了50倍的楊樹螢葉甲成蟲和幼蟲的基因組DNA作為模板，利用通用引物對其擴增，其分子量大小與預期大小基本一致。說明PCR體系也很好的滿足實驗要求，可以進行后續的產物測序。測序完成后，獲得了楊樹螢葉甲的成蟲和三齡幼蟲的COI基因序列。

楊樹螢葉甲屬于完全變態昆蟲，其幼蟲有三個齡期，而通過幼蟲的形態學觀察無法斷定其種類，DNA條形碼就可以快速準確的鑒定出來此幼蟲是否為楊樹螢葉甲。若鑒定出來，就可以采取合理的方法來進行有效的防治。隨著DNA條形碼技術的不斷發展，可以彌補傳統的昆蟲鑒定方法的不足之處，為簡單快速的鑒定昆蟲提供了方法。線粒體基因組的獲得對于所需的實驗材料要求很高，最好是100%酒精浸泡的新鮮標本；對DNA模板質量、PCR的反應條件、實驗操作過程及序列的測定都有很高的要求。因此，在對昆蟲測序上，利用DNA條形碼技術有優點也有缺點，還需要繼續更深入的研究。

注：*表示堿基相同,·表示缺失

Note:* expressed the same base, ·expressed the base deletion

圖4 楊樹螢葉甲三齡幼蟲和成蟲的COⅠ基因序列對比
Fig.4COⅠ gene sequence comparison between 3rdinstars larvae and adult ofAgelasticaalniorientalisBaly

4 結 論

通過對楊樹螢葉甲的成蟲和幼蟲總DNA的提取，PCR擴增后進行測序，獲得了楊樹螢葉甲的成蟲和幼蟲的COI基因的序列。由于成蟲和幼蟲的序列最高具有97.74%的一致性，可以根據所獲得的序列作為一個參考標準。DNA條形碼技術的應用如同平時在超市購物，可以通過刷條形碼來確定物品種類、價格。現在，COI基因的序列可作為楊樹螢葉甲DNA條形碼。所獲得的楊樹螢葉甲的COⅠ基因序列就可以作為該昆蟲的條形碼，對其各齡期進行快速準確鑒定，為害蟲的及時有效防治提供科學依據。

參考文獻(References)

[1]凌冰, 張茂新. 楊毛臀螢葉甲 (Agelastica alni orientalis Baly) 胚胎發育的觀察研究[J]. 新疆農業大學學報, 1996, 19(3): 36-39.

LIN Bing, ZHANG Mao-xin. (1996).Observations and Studies on the Embryonic Development of Agelastica alni orientalis Baly[J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity, 19(3): 36-39. (in Chinese)

[2]李勤,唐秀麗,王朝, 等. 烏魯木齊市及其周邊地區柳樹害蟲及寄生蜂資源初步研究[J]. 新疆農業科學, 2012, 49(7): 12.

LI Qin, TANG Xiu-li ,WANG Chao, et al. (2012). Preliminary Investigation of Willow Pests and Their Parasitic Wasps Resource in Urumqi and Its Surroundings [J].XinjiangAgriculturalSciences, 49(7):12. (in Chinese)

[3]溫娟, 陳睿,姜立云,等.基于DNA條形碼對北京地區薔薇科花卉上蚜蟲的快速鑒定[J]. 應用昆蟲學報,2013,50(1):29-40.

WEN Juan, CHEN Rui, JIANG Li-Yun , et al.(2013). Rapid identification of aphids on flowering plants of Rosaceae in Beijing based on DNA barcoding [J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 50 (1): 29-40. (in Chinese)

[4] 姚雪楠, 劉越, 薛堃, 等. 國內動物 DNA 條形碼研究進展評述[J]. 中國農業科技導報, 2013, 15(6): 99-106.

YAO Xue-nan, LIU Yue, XUE Kun, et al.(2013).Review of Domestic Research Progress on Animal Taxonomy DNA Barcoding [J].JournalofAgriculturalScienceandTechnology, 15(6): 99-106. (in Chinese)

[5]楊倩倩,李志紅,伍祎, 等. 線粒體COⅠ基因在昆蟲DNA條形碼中的研究與應用[J]. 應用昆蟲學報,2012, 49(6):1 687-1 695.

YANG Qian-Qian, LI Zhi-Hong, WU Yi, et al. (2012).Advance and application of mtDNA COⅠ barcodes on insects [J].ChineseJournalofAppliedEntomology,49(6):1,687-1,695. (in Chinese)

[6]聶瑞娥, 楊星科. 鞘翅目昆蟲線粒體基因組研究進展[J]. 昆蟲學報, 2014, 57(7): 15.

NIE Rui-e, YANG Xing-Ke. (2014). Research progress in mitochondrial genomes of Coleoptera [J].ActaEntomologicaSinica, 57(7):15. (in Chinese)

[7]張媛,郭曉華,劉廣純, 等. DNA條形碼在鞘翅目昆蟲分子系統學研究中的應用[J]. 應用昆蟲學報,2011, 48(2):410-416.

ZHANG Yuan, GUO Xiao-Hua, LIU Guang-Chun, et al. (2011). Application of DNA barcodes to molecular systematics of Coleoptera [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 48(2): 410-416. (in Chinese)

[8]周青松,張同心,于芳, 等. DNA條形碼在膜翅目昆蟲中的應用分析[J]. 應用昆蟲學報,2013, 50(1):19-28.

ZHOU Qing-song, ZHANG Tong-xin, YU Fang, et al.(2013) Application of DNA barcoding to Hymenopteran taxonomy [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 50(1):19-28. (in Chinese)

[9]張迎春,付景. 鞘翅目昆蟲核酸分子系統學研究現狀[J]. 昆蟲知識,2006,43(2):169-176.

ZHANG Ying-Chun, FU Jing. (2006). Current status of molecular systematic studies of nucleic acids in Coleoptera [J].ChineseBulletinofEntomology, 43(2):169-176. (in Chinese)

[10]陳曉琴,江世宏,李廣京. 分子生物學技術在鞘翅目昆蟲分類研究中的應用[J]. 華中農業大學學報,2008, 27(4):553-557.

CHEN Xiao-Qin, JIANG Shi-Hong, LI Guang-Jing. (2008). Application of Molecular Biologic Techniques in Coleoptera Systematic Studies [J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity, 27(4): 553-557. (in Chinese)

[11]鄭麗禎, 傅建煒, 楊廣, 等. 黃曲條跳甲酯酶基因片段的克隆及序列分析[J]. 應用昆蟲學報, 2013, 50(1): 126-132.

ZHENG Li-Zhen, FU Jian-Wei, YANG Guang, et al. (2013) .Cloning and sequence analysis of the esterase gene fragment of the striped flea beetle，Phyllotreta striolata [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 50(1): 126-132. (in Chinese)

[12]楊聰慧,韓輝林,遲美妍,等. DNA條形碼技術在北京百花山地區夜蛾科物種鑒定中的應用[J]. 昆蟲學報,2012, 55(9):1 082-1 092.

YANG Cong-hui, HAN Hui-lin, CHI Mei-yan, et al. (2012). Species identification of Noctuidae moths (Insecta: Lepidoptera ) from Baihuashan, Beijing, China with DNA barcoding [J].ActaEntomologicaSinica, 55(9):1,082-1,092. (in Chinese)

[13]田雷雷, 席景會, 李克斌, 等.利用兩種不同引物擴增金龜子COI序列片段的研究與對比[J]. 應用昆蟲學報, 2013, 50(1): 101-107.

TIAN Lei-lei, XI Jing-hui, LI Ke-bin, et a1. (2013). Research and comparison of the scarabmitochondrial cytochrome C oxidase Ⅰ(COⅠ) gene fragment sequence cloned by two different primers[J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 50(1): 101-107. (in Chinese)

[14] Hebert, P. D. N., Penton, E. H., Burns, J. M., Janzen, D. H., & Winnie, H. (2004). Ten species in one: dna barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly astraptes fulgerator..ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 101(41)：14,812-14,817.

[15]程希婷,王愛民,顧志峰,等.DNA 條形碼研究進展[J].基因組學與應用生物學, 2011, 30(6): 748-758.

CHENG Xi-ting, WANG Ai-min, GU Zhi-feng, et al. (2011). Current Progress of DNA Barcoding [J].GenomicsandAppliedBiology, 30(6): 748-758. (in Chinese)

[16]張莉, 蘇生, 呂召云, 等. 動物DNA條形碼鑒定技術及其在害蟲種類鑒定中的應用[J]. 貴州農業科學, 2014, 42(4):152-156.

Fund project:Supported by NSFC (U1170305) and National College Students New Training Projects (XJU-SRT-13049)

ZHANG Li, SU Sheng, LV Zhao-yun, et al. (2014). Animal DNA Barcoding Technology and Its Application in Pest Identification [J].GuizhouAgriculturalSciences, 42(4):152-156. (in Chinese)

DNA Barcoding ofAgelasticaalniorientalisBaly

(Coleoptera: Chrysomelidae)

XI Ou-yan, LI Xiao, ZHENG Fei, DUAN Xing-chen, TANG Xiu-li, HU Hong-ying

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract：【Objective】 Angelastica alniorientails Baly is mainly distributed in Xinjiang, and it is harmful to the leaf of willow and apple tree, the most harmful period of this pest to the crops is in its larval phase which is difficult to be identified. DNA barcoding is a new life identification system which can distinguish species rapidly and accurately by analyzing standard short DNA sequences with enough variation.【Method】By extracting the genomic DNA of Angelastica alniorientails Baly, the CO I gene was used as universal primers to PCR, and the accurate base sequence was got as the DNA barcoding of Angelastica alniorientails Baly.【Result】This study based on the theory that different instars of Angelastica ainiorientails Baly DNA sequence is always consistent. The CO I gene sequence of Angelastica alniorientails Baly in larva and adult can be obtained by the technology of DNA barcoding, and then analyse the serial.CO I gene sequence comparison between 3rd instars larvae and adult of Agelastica alni orientalis Baly,the results show that the similarity of up to 97.74%.So the sequences obtained can be used for preliminary identification of Agelastica alni orientalis Baaly.【Conclusion】Because this method can identify the species of pest simply, rapidly and accurately, it might be able to provide the primary data for pest prevention in time.

Key words:Agelastica alni orientalis Baly; DNA barcoding; COⅠ; rapid and accurate identification

通訊作者:胡紅英(1969-)，女，新疆人，教授，博士，博士生導師，研究方向為昆蟲學，(E-mail)hoohyi-69@163.com

作者簡介:席歐彥(1990-)，女，河南省碩士研究生，研究方向為生物學，(E-mail)13565801178@163.com

基金項目:國家自然科學基金項目(U1170305);國家大學生創新實訓項目(XJU-SRT-13049)

收稿日期：2015-10-08

中圖分類號：S188;S433.5

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)02-0309-08

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.017