白藜蘆醇改善亞臨床甲狀腺功能減退癥大鼠的學習記憶能力及其可能機制

秦 干，徐亞運，程江群，葛金芳

◇藥學研究◇

白藜蘆醇改善亞臨床甲狀腺功能減退癥大鼠的學習記憶能力及其可能機制

秦 干，徐亞運，程江群，葛金芳

目的觀察白藜蘆醇（RES）對亞臨床甲狀腺功能減退（SCH）大鼠學習記憶能力的影響并探討其可能機制。方法雄性成年SD大鼠，單側甲狀腺電凝毀損術建立SCH大鼠模型，隨機分為模型組、RES（15 mg/kg）組及左旋甲狀腺激素（LT4，60μg/kg）組，同時設假手術組，每組8只。灌胃給藥2周后采用Morris水迷宮和Y迷宮觀察大鼠學習記憶能力，放射免疫分析法檢測大鼠血漿促甲狀腺素（TSH）、游離甲狀腺素（fT4）和三碘甲腺原氨酸（T3）濃度，Real-time PCR和Western blot方法觀察大鼠海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達。結果與假手術組比較，SCH大鼠血漿TSH濃度顯著上升而T3和fT4濃度無明顯改變，LT4（60 μg/kg）和RES（15 mg/kg）灌胃給藥均可降低SCH大鼠升高的TSH濃度但LT4組大鼠血漿fT4濃度也顯著上升。與假手術組比較，SCH大鼠在Morris水迷宮和Y迷宮中的學習記憶能力顯著下降，并且海馬BDNF的mRNA及蛋白表達水平均顯著降低。LT4（60μg/kg）和RES（15 mg/kg）灌胃給藥2周可逆轉(zhuǎn)SCH大鼠受損的行為學表現(xiàn)并增加BDNF在海馬的表達。結論RES可改善SCH大鼠的學習記憶能力，其機制與調(diào)控SCH大鼠失衡的甲狀腺功能及海馬BDNF表達有關。

白藜蘆醇；亞臨床甲狀腺功能減退；Morris水迷宮；Y迷宮；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

亞臨床甲狀腺功能減退（subclinical hypothyroidism，SCH），臨床簡稱亞甲減，是指由于甲狀腺激素合成或釋放障礙而導致甲狀腺素分泌輕度減少，其實驗室檢查表現(xiàn)為血清促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）水平輕度升高，而血清游離甲狀腺素（free thyroxine，fT4）和三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）水平正常［1］。研究［2-3］表明，亞甲減可導致學習記憶能力下降。孕期甲狀腺功能低下可導致新生大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達下降［4］，而且TSH的中樞作用與BDNF的表達相關［5］。白藜蘆醇（resveratrol，RES），化學名稱為3，4′，5-三羥基-二苯乙烯，是一類主要存在于葡萄和虎杖等植物中的多酚類化合物，具有廣泛的抗炎及神經(jīng)保護作用［6-8］。該研究采用單側甲狀腺電凝毀損的方法建立亞甲減大鼠模型，觀察RES對亞甲減大鼠在Morris水迷宮和Y迷宮中的行為、血漿甲狀腺激素水平及海馬中BDNF表達的影響，以闡明RES對亞甲減大鼠學習記憶能力的影響并探討其可能機制，為RES的進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料RES（美國Sigma公司）；左旋甲狀腺素（levothyroxine，LT4）（德國默克公司）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；TSH的ELISA試劑盒（武漢華美生物有限公司）；T3和fT4放免試劑盒（北京北方所）；BDNF及β-actin一抗（美國Delaware公司）。RF-1雙極電凝器（上海市檢測技術所上立檢測儀器廠）；高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

1.2 SCH大鼠模型建立雄性SD大鼠，由安徽省實驗動物中心提供，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。采用單側甲狀腺電凝毀損術建立亞甲減大鼠模型，即麻醉后充分暴露甲狀腺，電凝毀損右側及峽部的甲狀腺組織。假手術組（8只）則暴露甲狀腺而不進行電凝毀損。手術后休息2周后將造模成功的24只SCH大鼠隨機分為模型組、RES（15 mg/kg）組及LT4（60μg/kg）組，每組8只。各組按上述劑量灌胃給藥，每天1次，持續(xù)2周。假手術組和模型組灌胃給予等體積溶媒。

1.3 行為學檢測行為學實驗在本院行為學實驗室獨立進行，實驗期間攝像機實時記錄大鼠的行為學表現(xiàn)并采用Any-maze行為學分析軟件分析。

1.3.1Morris水迷宮 采用本課題組的Morris水迷宮測試系統(tǒng)，迷宮直徑為1.6 m、高度為50 cm。實驗期間用食用色素將池水染成黑色并保持水深30 cm、水溫22～23℃，迷宮外參照物保持不變。實驗分定位航行和空間搜索兩部分。定位航行期間大鼠連續(xù)接受為期4 d的訓練，每天4次，每次入水前將小鼠置于水下平臺（水下1.3 cm）適應30 s，記錄大鼠60 s內(nèi)分別從4個象限不同入水點入水找到平臺的游泳距離，4次平均成績作為當日最終成績進入最后統(tǒng)計。第5天進行空間搜索實驗，即撤除平臺，從平臺對側象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)的游泳軌跡并進行分析。

1.3.2Y迷宮 Y迷宮包含3個完全相同的封閉臂，每個臂長48 cm，寬10 cm，高20 cm。實驗分訓練期和檢測期兩個階段。訓練期將其中一個臂封閉起來作為新異臂，另兩個臂一個固定為起始臂，一個為熟悉臂。將大鼠放入起始臂，使其在起始臂和熟悉臂探索10 min。24 h后進行檢測，此時開放新異臂，允許大鼠在三臂內(nèi)自由探索5 min，記錄并分析大鼠在新異臂的移動距離、停留時間，根據(jù)公式計算新異臂優(yōu)先指數(shù)。新異臂優(yōu)先指數(shù)=新異臂移動距離/總移動距離。

1.4 大鼠血漿T3、fT4和TSH濃度檢測行為學實驗結束24 h后，10%水合氯醛麻醉后腹主動脈采血，ELISA方法檢測血漿TSH濃度，放射免疫分析法檢測血漿T3和fT4濃度。

1.5 Real-timePCR方法檢測大鼠海馬BDNF mRNA的表達每組隨機選取5只大鼠，冰上分離雙側海馬，液氮處理后-80℃保存。TRIzol裂解液裂解左側海馬，手動勻漿器勻漿。按TRIzol三步法提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書和引物反應條件進行逆轉(zhuǎn)錄和目的基因擴增，β-actin為內(nèi)標。β-actin的引物序列為F：5′-TTGCTGACAGGATGCAGAA-3′和R：5′-ACCAATCCACACAGAGTACTT-3′；BDNF的引物序列為F：5′-GCGGCAGATAAAAAGACTGC-3′和R：5′-GTAGTTCGGCATTGCGAGTT-3′。反應體系為10μl，其中SYBR GreenMix（2х）5μl，cDNA 0.5μl，引物各0.3 μl，用無酶水補足。反應體系為10μl，其中SYBR Green Mix（2х）5μl，cDNA 0.5μl，引物各0.3μl，用無酶水補足。反應條件為：95℃，10min；95℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s；45個循環(huán)。

1.6 Westernblot檢測大鼠海馬BDNF的表達RIPA裂解液裂解右側海馬，勻漿后進行蛋白定量。取勻漿后等量組織加入蛋白變性劑，在沸水中煮沸10min進行蛋白變性。變性后取50μg蛋白用15% SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，孵育相應一抗（BDNF及β-actin濃度均為1/1 000）并4℃過夜、洗脫后加二抗37℃孵育2 h，洗脫后ECL顯色、曝光并進行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以-x±s表示。體重及Morris水迷宮中大鼠尋找平臺游泳距離的比較采用重復測量的單因素方差分析，血漿甲狀腺激素水平及大鼠其他行為學表現(xiàn)的組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法，相關性分析采用Pearson檢驗。

2 結果

2.1 RES對SCH大鼠體重及血漿甲狀腺激素濃度的影響重復測量的單因素方差分析結果表明，分組（F=2.81，P=0.05）及時間因素（F=162.38，P＜0.01）均對SCH大鼠的體重有影響，且存在交互效應（F=5.28，P＜0.01）。見圖1。

SCH大鼠血漿T3及fT4濃度與假手術組比較無顯著性差異，但血漿TSH濃度顯著上升（P＜0.01），符合人類SCH的診斷標準。與SCH組比較，LT4治療可降低血漿TSH濃度（P＜0.01），但同時引起血漿fT4濃度顯著上升（P＜0.01）。而RES（15 mg/kg）灌胃給藥僅降低血漿TSH濃度（P＜0.05），對血漿T3及fT4濃度無明顯影響。見表1。

2.2 RES對SCH大鼠學習記憶行為的影響

2.2.1RES對SCH大鼠在Morris水迷宮中行為的影響 各組大鼠在Morris水迷宮定位航行實驗中找到水下平臺的游泳距離見圖2A。重復測量的單因素方差分析結果表明，分組（F=13.93，P＜0.01）及時間因素（F=31.40，P＜0.01）均對SCH大鼠找到水下平臺的游泳距離有影響，兩者之間無交互效應（F=1.349，P=0.90）。

空間搜索實驗結果表明，各組大鼠在1 min自由游泳時間內(nèi)的游泳總距離和游泳速度無顯著性差異。與假手術組比較，SCH大鼠在平臺所在的目標象限的游泳距離顯著減少（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃給藥則可改善這一現(xiàn)象（P＜0.01）。見圖2B、C。

2.2.2RES對SCH大鼠在Y水迷宮中行為的影響

與假手術組比較，SCH大鼠在新異臂中的活動距離、停留時間和新異臂有限指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃給藥可增加SCH大鼠在新異臂中的活動距離、停留時間和新異臂優(yōu)先指數(shù)（P＜0.01）。見圖3。

2.3 RES對SCH大鼠海馬BDNFmRNA表達的影響SCH大鼠海馬BDNF的蛋白表達顯著低于假手術組（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃給藥可增加BDNF在大鼠海馬的mRNA表達（P＜0.01）。見圖4。Pearson相關性分析結果表明，BDNF在海馬的mRNA表達與血漿TSH濃度呈負相關性（r=-0.637，P=0.002）。

2.4 RES對SCH大鼠海馬BDNF蛋白表達的影響與假手術組比較，SCH大鼠海馬BDNF的蛋白表達顯著降低（P＜0.01），LT4和RES（15 mg/kg）灌胃給藥可增加BDNF在大鼠海馬的表達（P＜0.01）。見圖5。Pearson相關性分析結果表明，BDNF在海馬的蛋白表達與血漿TSH濃度呈負相關性（r=-0.717，P＜0.001）。

3 討論

甲狀腺激素替代療法是目前臨床治療亞甲減的主要措施之一。然而，由于亞甲減患者外周血中甲狀腺激素水平正常，亞甲減患者使用LT4的劑量難以確定。而且臨床使用中可出現(xiàn)治療過度引起的甲狀腺功能亢進或亞臨床甲狀腺功能亢進等不良反應［9］。因而，尋找治療亞甲減的新型藥物是神經(jīng)內(nèi)分泌領域長期關注的研究內(nèi)容之一。

本研究采用單側甲狀腺電凝手術建立了大鼠亞甲減模型并觀察了RES對亞甲減大鼠甲狀腺激素水平及學習記憶能力的影響。結果表明，亞甲減大鼠血漿TSH濃度顯著上升而T3和fT4濃度無明顯改變，LT4（60μg/kg）和RES（15 mg/kg）灌胃給藥均可降低SCH大鼠升高的TSH濃度。RES調(diào)控亞甲減大鼠血漿甲狀腺激素水平的能力可能與其和LT4相似的化學結構［10］、共同的作用位點［11］有關。值得一提的是，LT4治療后亞甲減大鼠血漿TSH水平下降，但同時存在血漿fT4濃度的過度上升，這與亞甲減的臨床甲狀腺替代療法中可導致14%～21%治療過度的報道［9］相一致。而RES治療則只改變血漿TSH水平，對fT4血漿濃度則無顯著影響，引起甲亢、亞甲亢等治療過度的不良反應有所降低。

行為學實驗顯示，亞甲減大鼠在Morris水迷宮的定位航行實驗中找到水下平臺所需的游泳距離延長，空間搜索實驗中在目標象限的游泳距離和停留時間減少；在Y迷宮中的新異臂移動距離、停留時間均減少，新異臂優(yōu)先指數(shù)下降，提示亞甲減大鼠存在學習記憶能力的下降。與臨床研究［5］的結果相一致，陽性藥物LT4治療后可提高亞甲減大鼠在行為學實驗中的表現(xiàn)。和LT4作用相仿，本研究結果提示RES也可改善亞甲減大鼠在Morris水迷宮和Y迷宮中的行為學表現(xiàn)。

海馬部位BDNF的表達與學習記憶能力密切相關［12-13］，并受到甲狀腺激素水平的影響［4-5］。本研究結果表明，亞甲減大鼠海馬BDNF的mRNA及蛋白表達水平均顯著下降，海馬BDNF的表達與血漿TSH濃度呈負相關，證實了BDNF在亞甲減大鼠學習記憶能力損傷中的作用。LT4和RES治療后則可顯著上調(diào)海馬BDNF的表達，提示RES的神經(jīng)保護作用機制除了已經(jīng)報道的抗氧化［8］及抗異常蛋白聚集作用［6-7］，還與調(diào)節(jié)海馬BDNF的表達有關。

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Resveratrol im proves the im paired learning and memory in subclinical hypothyroidism rats and the possiblemechanism

Qin Gan，Xu Yayun，Cheng Jiangqun，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol（RES）on the learning andmemory of subclinical hypothyroidism（SCH）rats and explore the possible mechanism.MethodsA SCH rat model was established through hemi-thyroid electric coagulation，and the SCH rats were divided randomly into 3 groups including SCH model group，RES（15 mg/kg）group and levothyroxine（LT4，60μg/kg）group.The rats in the sham group were only exposed thyroid without electric coagulation.2 weeks after operation，all the 32 rats received a daily intragastric administration of sterile saline solution，RESor LT4 with the corresponding dose.The learning and memory abilities of the ratswere tested using Morriswatermaze（MWM）and Y maze.The plasma concentrations of thyrotropic-stimulating hormone（TSH），free thyroxine（fT4），and thiiodothyronine（T3）were detected using ELISA and radioimmunoassaymethod，respectively.ThemRNA and protein expression of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）wasmeasured via real-time PCR and western blotmethod，respectively.ResultsThe SCH ratmodelwas successfully duplicated，as indicated by the elevated plasma thyrotropic-stimulating hormone（TSH）level with no changes of free thyroxine（fT4）and triiodothyronine（T3）concentration.Both RES（15 mg/kg）and LT4（60 μg/kg）could decrease the TSH concentration.Moreover，treatment with LT4 resulted in the increase of plasma fT4 level.In the MWM task and the Y maze task，the spatial learning and memory of the SCH ratswere impaired compared with the sham ones.However，these changeswere reversed by the treatment of RES（15mg/kg）or LT4（60μg/kg）.Furthermore，RES treatment up-regulated the mRNA and protein expression levels of BDNF in the hippocampus.ConclusionThese findings suggest an amelioration effect of RES on the impaired spatial learning and memory in SCH rats，themechanism of which might be involved with itsmodifying effect on the imbalance of the thyroid function and the hippocampal expression of BDNF.

resveratrol；subclinical hypothyroidism；Morriswatermaze；Y maze；brain-derived neurotrophic factor

R 964

A

1000-1492（2016）03-0378-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.030.html

2015-12-25接收

高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20133420120005）；安徽省2014年高校優(yōu)秀人才支持計劃（編號：KJ2014RC004）；安徽醫(yī)科大學中青年學術骨干資料基金（編號：0601020103）；安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：AH201410366125）

安徽醫(yī)科大學藥學院，合肥 230032

秦 干，男，本科生；

葛金芳，女，博士，副教授，碩士生導師，E-mail：gejinfang@ ahmu.edu.cn