采用ERIC-PCR與PFGE分析鮑曼不動桿菌基因型和同源性并對比方法學(xué)差異

聞海豐　馮忠軍　秦瑾　于文靜

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采用ERIC-PCR與PFGE分析鮑曼不動桿菌基因型和同源性并對比方法學(xué)差異

聞海豐1★馮忠軍1秦瑾2于文靜3

［摘要］目的比較脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）與腸桿菌科基因間重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERICPCR）檢測鮑曼不動桿菌同源性的結(jié)果差異。方法分別采用PFGE和ERIC-PCR對我院院內(nèi)分離的43株鮑曼不動桿菌進(jìn)行分型檢測。結(jié)果43株鮑曼不動桿菌通過PFGE分型得出：A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株；通過ERIC-PCR得出7種型別：Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2種方法結(jié)果相符率為76．8%。我院鮑曼不動桿菌存在克隆株傳播。結(jié)論ERIC-PCR操作簡便、結(jié)果可靠，與PFGE結(jié)果一致性高，2種分型方法均適合作為醫(yī)院進(jìn)行病原菌流行病學(xué)調(diào)查的分型檢測手段。

［關(guān)鍵詞］脈沖場凝膠電泳；腸桿菌科基因間重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；鮑曼不動桿菌

作者單位：1．河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院檢驗科，河北，石家莊050051

2．河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院感控科，河北，石家莊050051

3．河北省兒童醫(yī)院檢驗科，河北，石家莊050031

Comparison between PFGE and ERIC-PCR for genotyping and homologous analysis of Acinetobacter baumannii

WEN Haifeng1★, FENG Zhongjun1, QIN Jin2, YU Wenjing3
(1. Department of Laboratory Medicine, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, China, 050051; 2. Department of Noscomial Infection Control, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, China, 050051; 3. Department of Laboratory Medicine, Children's Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei, China, 050031)

［ABSTRACT］ObjectiveTo compare the pulsed field gel electrophoresis (PFGE) with the enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR) in genotyping and homologous analysis of Acinetobacter baumannii.MethodsPFGE and ERIC-PCR were used to test the genotypes of 43 isolates of Acinetobacter baumannii, respectively. Results43 isolates of Acinetobacter baumannii were classified into 7 genotypes by PFGE, including genotype A in 22 samples, genotype B in 10, genotype C in 3, genotype D in 4, genotype E in 2, genotype F in 1 and genotype G in 1. Correspondingly, they were categorized by using ERIC-PCR method as following 7 genotypes: typeⅠin 22, typeⅡin 10, type Ⅲin 3, typeⅣin 2, typeⅤin 3, typeⅥin 1 and typeⅦin the remaining 2 samples. The correlation coefficient between the two methods was 76.8%. It was suggested that there were spreads of clonal Acinetobacter baumannii among the patients in our hospital.ConclusionERIC-PCR is a simple and reliable method of bacterial genotyping. The data are highly correlated with the results acquired by PFGE. Bothmethods are suitable for applying in the epidemiological investigation of nosocomial infections.

［KEY WORDS］Pulsed field gel electrophoresis (PFGE); Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction(ERIC-PCR); Acinetobacter baumannii

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，ABA）為不動桿菌屬中最常見的一種需氧、非發(fā)酵、革蘭陰性球桿菌，廣泛分布于自然界的水及土壤中，正常人體的皮膚、呼吸道和尿道也有存在。由于近年鮑曼不動桿菌所引起的醫(yī)院感染暴發(fā)流行明顯增多［1］，耐藥性日益增強(qiáng)，已經(jīng)得到臨床的普遍重視。檢測醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動桿菌基因同源性是進(jìn)行院內(nèi)感染流行病學(xué)調(diào)查的重要手段，具有十分重要的流行病學(xué)意義。本研究分別采用脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和腸桿菌科基因間重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）2種方法對醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動桿菌進(jìn)行同源性檢測，并對比分析2種檢測方法的可靠性及一致性，為今后開展相關(guān)工作提供參考，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1．1標(biāo)本來源

2014年3月至2014年11月我院住院病人肺部感染患者送檢細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)過分離培養(yǎng)得到菌株43株，均為血培養(yǎng)和痰培養(yǎng)標(biāo)本，所有菌株均經(jīng)過API鑒定系統(tǒng)鑒定。

1．2主要試劑

溶菌酶（0．1 mg／mL，德國默克Merk公司），蛋白酶K（0．5 mg／mL，德國默克Merk公司），苯甲基磺酰氟（德國默克Merk公司），限制性內(nèi)切酶ApaI（美國NEB公司），Lambda Ladder PFG Marker（美國Bio-Rad公司），脈沖場級瓊脂糖（美國Bio-Rad公司），腸桿菌科和其它非苛氧革蘭陰性鑒定試劑盒ID32E鑒定試劑卡（法國生物梅里埃中國有限公司），5×TBE溶液（上海雙螺旋生物科技有限公司），10×TAE溶液（上海雙螺旋生物科技有限公司），ERIC-PCR引物（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），PCR綠色體系（加拿大富酶泰斯MBI Fermentas公司），GoldViewⅠ（北京索萊寶科技有限公司），瓊脂糖（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），DNA Marker DL2000（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1．3主要儀器

Genepath脈沖電泳儀Ⅱ型（美國Bio-Rad公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），API7300型熒光定量PCR檢測儀（美國生物應(yīng)用公司），BGPower 600通用電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），WD-9403F紫外儀（北京六一生物科技有限公司），TGL-16G高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1．4PFGE試驗方法

1．4．1細(xì)菌的包埋

取試驗菌落配制3麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙? mL，12 000 rpm離心2 min，棄上清，取0．05 mL細(xì)菌懸浮緩沖液，重新懸浮沉淀，平衡至50℃；加入50℃等體積2%Cleancut瓊脂糖凝膠，充分混合并灌注模具，4℃冰箱中凝固10 min～15 min。

1．4．2細(xì)菌的裂解

向膠塊加入0．3 mL溶菌酶稀釋液，37℃孵育2 h。無菌水清洗膠塊2次。加入0．3 mL蛋白酶K稀釋液，50℃孵育12 h，吸出蛋白酶K稀釋液，加清洗緩沖液充分清洗后加入1 mL濃度為1 mmol／L的苯甲基磺酰氟滅活剩余的蛋白酶K，室溫震蕩1 h后，重復(fù)清洗2次。

1．4．3限制性酶切

加入80 U限制性內(nèi)切酶ApaI和0．2 mL酶切緩沖液，37℃孵育過夜后清洗膠塊。

1．4．4加樣和電泳

用0．5×TBE緩沖液配制100 mL 1%的PFGE級瓊脂糖，制膠并小心上樣。在電泳槽中加入2 000 mL 0．5×TBE緩沖液，將凝膠放入電泳槽中，調(diào)節(jié)程序為起始轉(zhuǎn)換時間為1 s，最終轉(zhuǎn)換時間為17 s，電場強(qiáng)度6 V／cm，電場夾角120°，電泳時間18．5 h，非線性。

1．4．5結(jié)果圖像采集與分析

使用凝膠成像儀采集電泳結(jié)果圖像并進(jìn)行結(jié)果分析：把泳道中的條帶按照出現(xiàn)與否進(jìn)行二進(jìn)制積分，依據(jù)Dice系數(shù)（F）比較各菌株之間的相似性，F(xiàn)＝2Nxy／（Nx＋Ny）（Nxy：X和Y分離株之間共同擁有的條帶數(shù)目；Nx：X分離株的總的條帶數(shù)目；Ny：Y分離株之間總的條帶數(shù)目）。依據(jù)國外研究［2］報道，實驗以相似性系數(shù)80%為分型界值，相似度＝1為同一菌株，相似度≥80%為同一亞型，相似度＜80%為不同基因型。

1．5ERIC-PCR試驗方法

1．5．1細(xì)菌DNA模板的制備

將1 mL 0．5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?0 000 rpm離心1 min，向沉淀中加入180 μL Buffer GTL，混勻。加入20 μL蛋白酶K，混勻，56℃孵育，直至菌體完全裂解。加入200 μL Buffer GL，混勻。加200 μL無水乙醇，震蕩混勻。將所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，10 000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加500 μL Buffer GW1，10 000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加500 μL Buffer GW2，10 000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中，并重復(fù)一次。12 000 rpm離心2 min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫5 min，徹底晾干。將吸附柱置于一個新的離心管中。向吸附柱的中間部位懸空加入100 μL Buffer GE，室溫放置5 min，10 000 rpm離心1 min，收集DNA溶液，－20℃保存DNA。

1．5．2ERIC-PCR引物制備

根據(jù)文獻(xiàn)［3］合成ERIC-PCR引物：ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′—AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3，稀釋引物至濃度為10 μmol／L備用。

1．5．3ERIC-PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系總體積為50 μL：ERIC1，ERIC2各2 μL，DNA模板5 μL，PCR反應(yīng)綠色體系Green PCR Master Mix 25 μL，PCR超純水16 μL。

1．5．4PCR反應(yīng)條件

95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1．5．5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

以2%瓊脂糖制備電泳凝膠膠塊，以1×TAE溶液為電泳緩沖液，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳電壓110 V，電泳時間為45 min。

1．6統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù)2種分型方法的分型結(jié)果差異，通過SPSS 19．0進(jìn)行四格表卡方檢驗。

2　結(jié)果

2．1應(yīng)用PFGE對鮑曼不動桿菌分型結(jié)果

43株鮑曼不動桿菌經(jīng)提取基因組DNA后進(jìn)行脈沖場凝膠電泳，形成堿基條帶在10 bp～300 bp之間的指紋圖譜。通過分析PFGE電泳圖譜，43株鮑曼不動桿菌主要分為7型：A型（22株）、B型（10株）、C型（3株）D型（4株）、E型（2株）、F型（1株）、G型（1株），其中A型又被細(xì)分為A1、A2 共2種亞型，結(jié)果見圖1。

2．2應(yīng)用ERIC-PCR對鮑曼不動桿菌分型結(jié)果

43株鮑曼不動桿菌經(jīng)過ERIC-PCR后，形成5條左右的堿基條帶，條帶長度在100 bp～2 000 bp之間，通過分析，菌株可被分為通過ERIC-PCR分型，被分為Ⅰ型（22株），Ⅱ型（10株），Ⅲ型（3株），Ⅳ型（2株），Ⅴ型（3株），Ⅵ型（1株），Ⅶ型（2株）共7種型別，結(jié)果見圖2。

2．3應(yīng)用PFGE和ERIC-PCR分型結(jié)果對比分析

43株鮑曼不動桿菌通過PFGE和ERIC-PCR分型后，結(jié)果基本相互吻合，但是仍然存在少數(shù)標(biāo)本的分型結(jié)果差異，總體上結(jié)果一致率為76．8%，具體見圖3。43株鮑曼不動桿菌應(yīng)用PFGE與ERIC-PCR方法的分型結(jié)果以散點圖的分布形式表示，可見在A型（PFGE）與Ⅴ、Ⅵ型（ERICPCR），D型（PFGE）與Ⅰ型（ERIC-PCR）等處存在分型結(jié)果差異。

2．4統(tǒng)計學(xué)分析

比較PFGE和ERIC-PCR分型結(jié)果，以PFGE分型結(jié)果為基礎(chǔ)，并結(jié)合ERIC-PCR結(jié)果和菌株耐藥譜結(jié)果進(jìn)行校正，以此結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)對比2種分型方法的分型結(jié)果，進(jìn)行四格表卡方檢驗，見表1。43株醫(yī)院分離鮑曼不動桿菌PFGE結(jié)果中42株結(jié)果一致，1株不一致；ERIC-PCR分型結(jié)果中37株一致，6株不一致。經(jīng)卡方檢驗P＞0．05，可以認(rèn)為2種分型方法沒有顯著差別。

表1　對2種分型方法的分型結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗Table 1　The Chi square test results of two genotyping methods

3　討論

鮑曼不動桿菌是不動桿菌屬中最主要的菌株之一，由于鮑曼不動桿菌具有耐干燥［4］，生存能力強(qiáng)，有較強(qiáng)的消毒劑抗性［5］，對多種抗生素耐藥嚴(yán)重［6］，所以在醫(yī)院內(nèi)有很強(qiáng)的生存力，是近年來引起醫(yī)院暴發(fā)流行的重要病原菌之一。對醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動桿菌進(jìn)行菌株分型，檢測其同源性，是對鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，有效控制鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染暴發(fā)流行的重要手段，具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)［7］，同一基因型的不同菌株，其抗生素耐藥譜是可能并經(jīng)常存在不同程度的差別，進(jìn)一步說明了在對菌株進(jìn)行流行病學(xué)研究時應(yīng)用基因分型取代傳統(tǒng)應(yīng)用耐藥譜分型的必要性。近年來國內(nèi)外最常用的病原菌分子生物學(xué)水平的分型方法主要為PFGE［8］分型法和ERIC-PCR［3］分型法。2種分型方法在方法原理上存在較大的差別：PFGE通過對細(xì)菌的全部基因組DNA進(jìn)行消化切割，產(chǎn)物在動態(tài)變換角度的電場中電泳，依據(jù)消化產(chǎn)物的大小及構(gòu)象而分離出指紋圖譜，依此作為分型的依據(jù)；而ERIC-PCR是利用腸桿菌科基因的高度保守并且重復(fù)的序列設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不同的指紋圖譜，進(jìn)行基因分型。PFGE分型指紋圖譜圖像分辨力強(qiáng)，結(jié)果辨識度和重復(fù)性好，操作標(biāo)準(zhǔn)化，并且有成熟分型結(jié)果數(shù)據(jù)庫，PFGE被國內(nèi)外分子流行病學(xué)者廣泛認(rèn)同，被認(rèn)為是病原菌分子生物分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法［9］。ERIC基因雖然是保守序列，但是細(xì)菌基因組DNA中依然可能出現(xiàn)該基因不完整、缺失、突變等情況發(fā)生，甚至?xí)?dǎo)致試驗變成一種隨機(jī)擴(kuò)增實驗［10］，又由于ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度不能確定，也會在電泳的時候出現(xiàn)條帶缺失，產(chǎn)量低的條帶顯像模糊或條帶分辨不清晰等情況，所以PFGE和ERIC-PCR 2種分型方法結(jié)果可能會存在差異。近年來的多項研究報告了對PFGE與ERICPCR 2種分型方法應(yīng)用在多個種屬間的病原菌分型和分型結(jié)果對比［11－15］，本研究也平行對比了2種分型方法在鮑曼不動桿菌分型結(jié)果。

本研究對我院臨床分離43株鮑曼不動桿菌采用PFGE和ERIC-PCR2種方法進(jìn)行基因分型，均分出7種型別。分型結(jié)果顯示，通過PFGE分型的B型菌株與通過ERIC-PCR分型的Ⅱ型菌株全部吻合對應(yīng)，通過PFGE分型的C型菌株與通過ERICPCR分型的Ⅲ型菌株全部吻合對應(yīng)，通過PFGE分型的E型菌株與通過ERIC-PCR分型的Ⅶ型菌株全部吻合對應(yīng)，實驗中有15株鮑曼不動桿菌通過PFGE和ERIC-PCR 2種分型方法的結(jié)果高度一致，占總分型菌株的34．9%。通過PFGE分型的所有A1菌株和所有D型菌株共同對應(yīng)ERIC-PCR分型的所有22株Ⅰ型菌株，2種分型方法的分型結(jié)果基本一致。而實驗中有10株鮑曼不動桿菌通過2種分型方法得到的分型結(jié)果存在明顯差異。實驗結(jié)果顯示，2種分型方法所得到的大多數(shù)菌株的分型結(jié)果可以完全對應(yīng)，少量菌株的分型結(jié)果呈現(xiàn)為多種PFGE型別對應(yīng)一種ERIC-PCR型別。實驗結(jié)果顯示2種分型方法在區(qū)分主要型別方面一致性非常高，分型結(jié)果總體一致率達(dá)到76．8%，只是在非主要型別和亞型的區(qū)分上存在一定差異，通過統(tǒng)計學(xué)卡方檢驗，P＞0．05，可以認(rèn)為2種分型方法的分型結(jié)果沒有顯著差異，與國內(nèi)外相關(guān)研究報道相一致。Merzougui等［12］研究認(rèn)為PFGE具有較好的分型辨別力，但PFGE分型周期長，ERIC-PCR可以作為其很好輔助和補(bǔ)充分型方法，孫晶等［14］研究同樣顯示PFGE和ERIC-PCR方法的病原微生物分型結(jié)果表現(xiàn)出較好的一致性。但國外也有研究報道PFGE與ERIC-PCR的分型結(jié)果缺少關(guān)聯(lián)性［15］，ERIC-PCR是基于腸桿菌科基因間保守重復(fù)序列的分型技術(shù)，該技術(shù)對于乳球菌屬等菌屬分型的型別辨識度低可能是其中的重要原因。本實驗研究對比2種分型結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：通過PFGE分型方法對鮑曼不動桿菌分型時，對某些型別的分辨率要優(yōu)于ERIC-PCR方法，PFGE方法對型別的辨識度更高，此結(jié)論也與國外相關(guān)研究結(jié)論相一致［13，15］。

通過PFGE［16］和ERIC-PCR［17］都可以很好地對我院分離鮑曼不動桿菌進(jìn)行分型和菌株同源性分析。PFGE對儀器設(shè)備要求較高，試劑耗材較貴，操作復(fù)雜、時間周期長，因此PFGE在國內(nèi)開展并不十分廣泛。ERIC-PCR方法簡單、快速，對儀器設(shè)備和試劑等要求相對較低，更方便醫(yī)院廣泛開展。總之，PFGE和ERIC-PCR方法都可以較好的完成對鮑曼不動桿菌的分型和同源性分析，達(dá)到有效的控制鮑曼不動桿菌在醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)流行的目的。

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?論著?

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通訊作者：★聞海豐，E-mail：50559419＠qq．com

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃（20110099）