依達拉奉對大鼠心肌轉化生長因子-β1表達及心肌纖維化的影響

王世祥，吳宏超，劉映峰

?

依達拉奉對大鼠心肌轉化生長因子-β1表達及心肌纖維化的影響

王世祥，吳宏超，劉映峰△

摘要：目的觀察依達拉奉抗大鼠心肌纖維化作用并探討轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達水平與心肌纖維化的關聯性。方法40只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組和依達拉奉低、中、高劑量組。采用異丙腎上腺素（ISO）建立大鼠心肌纖維化模型。依達拉奉各劑量組予以依達拉奉[分別為3、5、10mg/（kg·d）]干預14 d。第15天檢測超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）水平，計算左心室質量指數（LVMI）、膠原容積分數（CVF）；采用免疫熒光和Western blot檢測TGF-β1的表達。結果與對照組比較，模型組的MDA、LVMI均顯著升高，而SOD顯著降低（P < 0.01）。與模型組比較，依達拉奉各劑量組隨干預劑量增加，MDA表達遞減，SOD表達遞增（P < 0.05）；依達拉奉中劑量組SOD與對照組差異無統計學意義，而LVMI呈遞減（P < 0.01），依達拉奉高劑量組LVMI與對照組差異無統計學意義。模型組TGF-β1較對照組表達明顯上調，依達拉奉各劑量組TGF-β1的表達隨劑量的增加而減少，條帶灰度減弱。模型組CVF較對照組顯著增加；依達拉奉中、高劑量組CVF隨劑量的增加而降低，但均高于對照組（P < 0.01）。TGF-β1與MDA、LVMI、CVF呈正相關（r分別為0.931、0.879、0.930，P < 0.001），與SOD呈負相關（r=-0.892，P < 0.001）。結論依達拉奉具有通過減輕氧化應激水平和抑制TGF-β1表達而達到抗心肌纖維化作用。

關鍵詞：氧化應激；纖維化；心肌；轉化生長因子β1；依達拉奉

1　材料與方法

1.1藥品與試劑依達拉奉（南京先聲東元制藥有限公司，國藥準字H20050280），異丙腎上腺素（湖北康寶泰，CAS No：7683-59-2），超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑（南京建成生物工程研究所），TGF-β1抗體（cell signaling technical，USA），辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2儀器酶標儀（Thermo，Multiskanmk3），倒置熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B），電泳儀（上海培清，JS-Power300），電泳槽（Tanon，VE-180），冷凍高速離心機（珠海黑馬，TGL-16R），電子分析天平（DENVER INSTRUMENT，TP-214），微型離心機（BMJ，BMJ0826）。

1.3動物實驗及分組SPF級雄性SD成年大鼠40只，體質量約300 g，由中山大學實驗動物中心提供（合格證號：44008500006902）。按照隨機數字表法分成對照組、模型組及依達拉奉低、中、高劑量組，每組8只。動物實驗方法符合南方醫科大學動物福利和倫理管理委員會要求。

1.4造模及給藥方法參考Leenen等[4]的方法，模型組和依達拉奉低、中、高劑量組首次背部皮下注射異丙腎上腺素20.0mg/kg，第2天背部皮下注射10.0mg/kg，第3天注射5.0mg/kg，第4天起3.0mg/kg，連續1周。自由進食、飲水。依達拉奉低、中、高劑量組即在異丙腎上腺素基礎上分別給予依達拉奉3、5、10mg/（kg·d），從第2天開始經尾靜脈給藥，每日2次，連續14 d，造模和給藥間隔時間4h以上。對照組給予等量的生理鹽水，給予方式、給予時間同實驗組。模型組建模1周后，處理同對照組。

1.5酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清SOD、MDA含量末次給藥后，全部大鼠禁食24h，于第15天予10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉后經尾靜脈取血。按試劑盒說明書采用ELISA法檢測血清SOD水平和MDA含量。

1.6左心室質量指數（LVMI）測定和心肌組織標本處理全部大鼠經上述取血后，稱其體質量（BW）后處死，取出心臟，剔除心房、大血管、心外膜脂肪組織及瓣膜，生理鹽水清洗，濾紙吸干，沿房間隔和室間隔剪去左心耳、心房、右室游離壁和血管，電子天平稱量包括室間隔在內的左心室質量（LVM），計算LVMI：LVMI=LVM/BW。剪取大鼠心尖部約5mm×5mm×5mm心肌組織，置于液氮中速凍后于-80℃保存，待分子生物學實驗用。取剩余部分心臟組織，立即置于4%多聚甲醛緩沖液固定，常規石蠟包埋，制成3～4 μm厚石蠟切片，待病理檢測用。

1.7心肌組織Masson染色將制成的心肌組織石蠟切片，每組隨機取3張，經Masson染色，每張切片隨機讀取6個不重疊的視野（×400）進行圖像采集，用CISA-1000計算機圖像分析系統進行分析。膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）為膠原面積/總面積，取平均值作為該切片的CVF進行統計。

1.8免疫熒光法檢測TGF-β1蛋白表達從已制成的心肌組織石蠟切片中，每組隨機取3張，按照試劑盒說明操作，石臘切片經二甲苯脫蠟2次，每次10min。依次經梯度乙醇脫水。PBS洗5min。3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫濕盒孵育10min，PBS洗3×5min。置于檸檬酸抗原修復液，于微波爐中加熱至沸騰，低火維持沸騰繼續加熱8min，待水溫自然降至室溫，PBS洗3×5min。10%山羊血清室溫濕盒封閉30min。一抗4℃孵育過夜。PBS洗3×5min。熒光二抗室溫避光孵育30min，PBS洗3×5min。DAPI室溫濕盒避光孵育5min。PBS洗1×5min，ddH2O洗2×5min；熒光抗淬滅劑封片。鏡檢，拍照。

1.9Western blot檢測TGF-βl蛋白表達取100mg心肌組織進行勻漿，4℃14 000 r/min離心10min，將上清液轉入新的試管內，取10 μL蛋白提取液，用考馬斯亮藍法進行定量。取100 μg蛋白加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠，轉印至PVDF膜，麗春紅S染色，與標準蛋白條帶對比確定目的片段位置。轉膜后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2h，加入單克隆抗體TGF-β1（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜。第2天膜浸于一抗溶液中，室溫平衡1h后，洗膜5次，每次7min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h。TBST溶液洗膜5次，每次7min。采用辣根過氧化物酶HRP-ECL化學發光法檢測蛋白條帶。以β-actin為內參。用Image J軟件計算TGF-β1與β-actin灰度值的比值代表其相對表達量。

1.10統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用t檢驗；多組均數間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。相關性分析采用Pearson法。P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1存活情況模型組死亡2只，余均無死亡。

2.2各組MDA、SOD、LVMI的結果比較模型組MDA、LVMI較對照組均顯著升高，而SOD顯著降低（P < 0.01）。依達拉奉各劑量組隨干預劑量增加，MDA含量和LVMI逐漸降低，且均低于模型組，依達拉奉高劑量組MDA含量仍高于對照組，而LVMI與對照組差異無統計學意義。依達拉奉各劑量組隨干預劑量增加，SOD水平逐漸增高，且均高于模型組（P < 0.05）；依達拉奉中劑量組與對照組差異無統計學意義，見表1。

Tab.1　Comparison of expression levels ofmDA, SOD and LVMI between five groups表1　各組MDA、SOD、LVMI的比較　（±s）

Tab.1　Comparison of expression levels ofmDA, SOD and LVMI between five groups表1　各組MDA、SOD、LVMI的比較　（±s）

＊＊P < 0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05；表2同

組別對照組（1）模型組（2）依達拉奉低劑量組（3）中劑量組（4）高劑量組（5）F n8 6　8 8 8mDA（μmol/L）1.048±0.036 1.779±0.034aSOD（U/mL）66.934±3.766 43.025±2.310aLVMI（mg/g）1.803±0.023 2.639±0.042a1.650±0.028ab1.409±0.020abc1.174±0.042abcd88.521＊＊52.236±3.096ab65.886±3.269bc79.026±0.470abcd24.458＊＊2.146±0.031ab1.942±0.036abc1.841±0.018bcd119.421＊＊

2.3Masson染色結果發生纖維化的心肌纖維和血管周圍被染成藍色，未發生纖維化的心肌組織被染成紅色。模型組CVF較對照組顯著增加；依達拉奉各劑量組CVF隨劑量的增加而降低，且均高于對照組，中、高劑量組CVF較模型組顯著降低（均P < 0.01），而低劑量組與之差異無統計學意義，見表2。

Tab.2　Comparison of relative expression level of TGF-β1protein andmasson staining of CVF between five groups表2　各組TGF-β1相對表達量、Masson染色CVF的比較　（±s）

Tab.2　Comparison of relative expression level of TGF-β1protein andmasson staining of CVF between five groups表2　各組TGF-β1相對表達量、Masson染色CVF的比較　（±s）

組別對照組（1）模型組（2）依達拉奉低劑量組（3）中劑量組（4）高劑量組（5）F n8 6　8 8 8 TGF-β1/β-actin 0.256±0.006 1.044±0.036aCVF（%）2.523±0.194 17.825±0.910a0.954±0.040a0.591±0.037abc0.495±0.031abcd102.153＊＊16.653±1.143a14.495±1.419ab9.028±0.561abcd44.700＊＊

2.4免疫熒光檢測TGF-β1表達的變化模型組心肌組織TGF-β1熒光較強，依達拉奉劑量低、中、高劑量組TGF-β1熒光強度遞減，見圖1。

2.5Western blot檢測心肌TGF-β1蛋白的表達變化模型組TGF-β1較對照組表達明顯增強，依達拉奉各劑量組TGF-β1的表達隨劑量的增加而減少，條帶灰度減弱，其中依達拉奉中、高劑量組較模型組顯著降低，而低劑量組與之差異無統計學意義，依達拉奉高劑量組仍高于對照組，見表2、圖2。

Fig.1　The immunofluorescence results showing TGF-β1inmyocardial tissues（×400）圖1　各組心肌組織TGF-β1免疫熒光圖（×400）

Fig.2　The expression of TGF-β1protein detected by Western blot assay圖2　Western blot檢測各組TGF-β1蛋白表達情況

2.6相關性分析TGF-β1與MDA、LVMI、CVF呈正相關（r分別為0.931、0.879、0.930，P < 0.001），與SOD呈負相關（r= -0.892，P < 0.001）。

3　討論

3.1氧化應激在心肌纖維化中的作用心肌纖維化的進展最終導致惡性心律失常、心功能不全和心源性死亡[5-6]。因此，有效預防或逆轉心肌纖維化的發生，遏制心血管疾病的進展已成為目前心血管疾病研究的重點方向。氧化應激是指由于活性氧簇過量生成和（或）細胞內抗氧化防御系統受損，導致活性氧簇及其相關代謝產物過量聚集，從而對細胞產生多種毒性作用的病理狀態[7-8]。氧化應激被認為是導致心肌纖維化的重要因素。MDA是脂質過氧化產物，反映機體氧化應激水平。SOD是人體一種抗氧化酶，其活力可反映機體清除氧自由基的能力及抗氧化物質的水平。本實驗中模型組LVMI值明顯升高，提示使用ISO后大鼠心肌間質纖維化明顯，經Masson染色可見模型組心肌壞死灶內纖維增生明顯，表明心肌纖維化模型制備成功。模型組較對照組MDA明顯升高而SOD降低，表明模型組氧化應激明顯。由此表明隨著氧化應激的增加，心肌纖維化水平升高，這與李貴芝等[9]研究結論一致。

3.2依達拉奉抗氧化應激、抑制TGF-β1及抗心肌纖維化作用依達拉奉具有親脂性基團，可以有效降低羥自由基濃度、抑制氫氧根離子與鐵離子所介導的脂質過氧化，并抑制細胞及組織氧化損傷[9]。在Tajima等[10]的研究中發現，依達拉奉能減輕氧化應激、清除并阻止氧自由基，進而抑制博來霉素誘導的小鼠肺損傷和肺纖維化。依達拉奉可以阻止大鼠自身免疫性心肌炎向擴張型心肌病的發展[11]。TGF-β1的作用在于參與調節細胞外基質（ECM）合成，如促進基質金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-9表達升高而抑制TIMP表達，促進ECM合成，并且有強烈的致纖維化作用[12]。氧化應激能誘導成纖維細胞增殖及ECM的分泌，是激活TGF-β1的重要啟動因素，與下游的關鍵受體Smads蛋白共同調控心肌纖維化。本實驗通過Western blot及免疫熒光檢測各組大鼠心肌組織TGF-β1的表達發現，TGF-β1的表達隨依達拉奉干預劑量增加而減少；氧化應激促進TGF-β1表達，導致心肌纖維化，而依達拉奉具有抑制TGF-β1表達，減輕心肌纖維化的作用。經相關分析，CVF和LVMI均與TGF-β1呈正相關，這與Meredith等[13]研究結果一致。本研究中，中劑量組和高劑量組的依達拉奉顯示了具有較明顯的抗心肌纖維化作用，但其最優劑量需要進一步探討。

綜上所述，本研究初步表明，依達拉奉具有減輕氧化應激、抑制TGF-β1的表達進而發揮抗心肌纖維化的作用，為心血管疾病的防治提供了新的思路，值得進一步研究。

參考文獻

[1] SonghX, Li Y, SunmY，et al.Effect of cellular repressor of E1A stimulated genes（CREG1）on cardiac function injury induced by angiotensinⅡinmice [J].Med J Chin PLA, 2015,40（1）:16-21.[宋海旭，李洋，孫鳴宇，等，CREG1蛋白對血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心功能損傷的影響[J].解放軍醫學雜志, 2015,40（1）:16-21].doi:10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.04.

[2] Purnomo Y, Piccart Y, Coenen T, et al.Oxidative stress and trans?forming growth factor-β1- induced cardiac fibrosis[J].Cardiovaschematol Disord Drug Targets，2013，13（2）: 165-172.

[3] Itohh, Kishore AH，Lindqvist A, et al.Transforming growth factor β 1（TGFβ1）and progesterone regulatematrixmetalloproteinases （MMP）inhuman endometrial stromal cells[J].J Clin Endocrinolmetab, 2012, 97（6）:E888-897.doi: 10.1210/jc.2011-3073.

[4] Leenen FH, White R, Yuan B, et al.Isoproterenol-induced cardiachypertrophy: role of circulatory versus cardiac renin- angiotensin system[J].Am J Physiolheart Circ Physiol，2001，281（6）:H2410-2416.

[5] Weber KT, Sun Y, Bhattacharya SK, et al.Myofibroblast-mediatedmechanisms of pathological remodelling of theheart[J].Nat Rev Cardiol, 2013, 10（1）: 15-26.doi: 10.1038/nrcardio.2012.158.

[6] Kovacic JC,mercader N, Torresm, et al.Epithelial-to-mesenchy?mal and endothelial- to-mesenchymal transition:from cardiovascu?lardevelopment to disease[J].Circulation, 2012 ,125（14）:1795-1808.doi:10.1161/CIRCUL ATIONAHA.111.040352.

[7] Chen YR, Zweier JL.Cardiacmitochondria and reactive oxygen spe?cies generation[J].Circ Res，2014, 114（3）:524-537.doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.300559.

[8]murray TV, Ahmad A, Brewer AC.Reactive oxygen at theheart ofmetabolism[J].Trends Cardiovascmed, 2014, 24（3）:113-120.doi: 10.1016/j.tcm.2013.09.003.

[9] Li GZ, Zhouh, Fang CX, et al.Fasudilhydrochloridehydrate ame?lioratesmyocardial fibrosis through inhibiting oxidative stress in rats with type 2 diabetes [J].Basic & Clinicalmedicine，2014, 34 （2）:216-221.[李貴芝，周紅，房彩霞，等.法舒地爾抑制氧化應激反應減輕2型糖尿病大鼠心肌纖維化[J].基礎醫學與臨床，2014，34（2）：216-221].

[10] Tajima S，Bandom，Ishii Y，et al.Effects of edaravone，a free-radical scavenger，on bleomycin-induced lung injury inmice [J].Eur Respir J，2008，32（5）：1337-1343.doi: 10.1183/09031936.00164407.

[11] Arumugam S，Thandavarayan RA，Veeraveedu PT，et al.Involve?ment of AMPK andmAPK signaling during the progression of ex?perimental autoimmunemyocarditis in rats and its blockade using a novel antioxidant[J].Expmol Pathol，2012，93（2）:183- 189.doi: 10.1016/j.yexmp.2012.04.012.

[12] Yang Q, Wang Y, Li LX, et al.The effects of tea polyphenols on airway inflammation and airway remodeling in asthmatic rat[J].Tianjinmed J, 2012, 40（11）: 1138-1141.[楊青，王堯，李里香，等.茶多酚對哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的干預研究[J].天津醫藥，2012，40（11）：1138-1141].doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2012.11.016.

[13]meredith A, Boroomand S, Carthy J, et al.1,25 Dihydroxyvitamin D3 inhibits TGFβ1-mediated primaryhuman cardiacmyofibroblast activation[J].PLoS One, 2015, 10（6）:e128655.doi: 10.1371/jour?nal.pone.0128655.

（2015-04-29收稿2015-09-08修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of edaravone on the expression of TGF-β1andmyocardialfibrosis in rats

WANG Shixiang，WUhongchao，LIU Yingfeng△
Department of cardiology, Zhujianghospital, Southernmedical University, Guangzhou 510280, China
△Corresponding Author E-mail：2415140659@qq.com

Abstract：Objective To investigate the effects of edaravone onmyocardial fibrosis induced by isoproterenol (ISO) in rats, and to discuss the correlation between the level of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and themyocardial fibrosis.Methods Fortymale SD rats were randomly divided into five groups, namely control group,model group and edaravone groups (low,medium andhigh doses).Isoproterenol was used to establish the ratmodel ofmyocardial fibrosis.Edaravone groups were given edaravone [3, 5 and 10mg/(kg·d)] to intervene for 14 days.The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level ofmalondialdehyde (MDA) were examined after 15-d treatment.The left ventricularmass index (LVMI) and collagen volume fraction (CVF) were examined.The expression of TGF-β1was detected by Western blot assay and immuno?fluorescencemethod.Results The content ofmDA and LVMI were significantlyhigher inmodel group than those of the control group (P < 0.01)，whereas the content of SOD was significantly lower inmodel group than that of the control group (P < 0.01).Compared withmodel group, the expression level ofmDA decreased with the increased intervention dose of edara?vone (P < 0.05), while SOD expression level increased (P < 0.05).There was no significant difference in the level of SOD be?tweenmiddle dose edaravone group and the control group.LVMI was decreased with the increased doses of edaravone (P < 0.01).There was no significant difference in LVMI between thehigh dose of edaravone group and the control group.Com?pared with the control group, the expression level of TGF-β1was significantly increased inmodel group (P < 0.01).The ex?pression level of TGF-β1was reduced with the increased doses of edaravone.CVF was significantly increased inmodel group compared with that of control group (P < 0.001).CVF decreased with the increased doses of edaravone inmedium andhigh doses of edaravone groups, but they werehigher than that of control group (P < 0.01).TGF-β1 was positively correlated withmDA, LVMI and CVF (r=0.931, 0.879 and 0.930, P < 0.001).SOD was negatively correlated with TGF-β1(r= -0.892, P < 0.001).Conclusion Edaravone can relievemyocardial fibrosis by inhibiting oxidative stress and TGF-β1in rats.

Key words：oxidative stress；fibrosis；myocardium；transforming growth factor beta1；Edaravonebook=68,ebook=73心肌纖維化是多種心臟疾病終末期的共同病理改變，也是心功能由代償期向失代償期轉換的關鍵環節[1]，它主要表現為Ⅰ型和Ⅲ型膠原比例的失調和含量增加。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達增加是諸多因素所致心室纖維化的共同通路。研究表明，氧化應激可以刺激心肌成纖維細胞中TGF-βl的表達[2]。依達拉奉為臨床常用的一種新型自由基清除劑，能有效清除自由基，減輕氧化應激。既往有研究通過動物實驗證實依達拉奉能抑制肺纖維化[3]。然而其是否能夠通過清除氧自由基減輕氧化應激來抑制TGF-β1表達，進而發揮抗心肌纖維化的作用鮮見報道。本實驗擬通過觀察依達拉奉對異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化大鼠模型進行干預，探討依達拉奉抗心肌纖維化的作用及其作用機制。

通訊作者△E-mail：2415140659@qq.com

作者簡介：王世祥（1980），男，博士在讀，主要從事慢性心力衰竭診治與康復研究

中圖分類號：R542.2+3

文獻標識碼：A

DOI:10.11958/58841

作者單位：南方醫科大學附屬珠江醫院心內科（郵編510280）