重組人白細胞介素-11對肺腺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

肖榮，康馬飛，駱梅青，董翠梅，劉秀麗

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重組人白細胞介素-11對肺腺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

肖榮，康馬飛△，駱梅青，董翠梅，劉秀麗

摘要:目的觀察重組人白細胞介素-11（rhIL-11）對肺腺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步探討其影響機制。方法分別以0、10、20、50、100 μg/L終濃度的rhIL-11作用于A549細胞，MTT法測定A549細胞增殖程度；用0、10、40、80 μg/L終濃度的rhIL-11作用于A549細胞，劃痕實驗和Transwell侵襲實驗測定A549細胞的遷移和侵襲能力；Western blot檢測基質金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9蛋白水平的表達。結果rhIL-11對A549細胞增殖能力無影響；rhIL-11作用于A549細胞后，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強；rhIL-11能顯著上調MMP-2和MMP-9的表達，且表達隨rhIL-11濃度的增高而增高（P < 0.05）。結論rhIL-11能夠促進A549細胞的遷移和侵襲，促進MMP-2、MMP-9上調為其可能的機制之一。

關鍵詞：白細胞介素11；癌,非小細胞肺；細胞遷移分析；腫瘤侵潤；基質金屬蛋白酶2；基質金屬蛋白酶9；重組人白細胞介素11

白細胞介素（IL）-11屬于IL -6因子家族，是一種由人骨髓基質細胞及間質細胞分泌的多功能細胞因子。重組人白細胞介素11（rhIL-11）因參與調控血小板的生成而被臨床用于治療各種原因引起的血小板減少癥，尤其是放化療后的血小板減少。然而，研究發現，rhIL-11對胃癌細胞的侵襲和遷移能力有促進作用[1]。但rhIL-11對A549肺腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲能力的影響尚鮮見報道。本研究旨在觀察rhIL-11對人肺腺癌細胞株A549細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響，并對其可能的機制進行探討。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑人非小細胞肺腺癌細胞株A549購自中科院上海細胞保藏中心。細胞培養基購自美國GIBICO公司。胎牛血清購自Hyclone。細胞培養板購自廣州杰特生物公司。Transwell小室購自美國BD公司。兔源GAPDH抗體、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9抗體購自萬類生物公司。羊抗兔二抗購自北京中杉金橋有限公司。rhIL-11由齊魯制藥有限公司生產。

1.2細胞培養人肺腺癌A549細胞培養于含10%的胎牛血清PRMI1640培養液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度環境中培養。

1.3MTT法檢測rhIL-11對A549細胞增殖的影響取對數生長期A549細胞，制成1.75×104/mL的細胞懸液，每孔3 500個接種于96孔板，次日加入不同濃度的rhIL-11，終濃度分別為10、20、50、100 μg/L，對照組正常培養，每組設6個平行孔，37℃培養24、48、72h。以MTT法檢測細胞增殖水平。

1.4劃痕實驗檢測rhIL-11對A549細胞遷移能力的影響用Marker筆在6孔板背后標記6條Marker線。取對數生長期A549細胞接種到6孔板中，每孔接約15×104個細胞，放入37℃，5%CO2培養箱培養，24h后細胞鋪滿開始劃痕實驗。用滅菌的200 μL黃色槍頭在每個孔中間劃一條痕，PBS洗2遍，去除劃下的細胞，用正置顯微鏡拍照。換不同濃度的rhIL-11（10、40、80 μg /L）無血清培養液繼續培養，對照組用無血清培養基代替藥物，每組設3個平行。24h后顯微鏡拍照，對應Marker線測量劃痕距離。用Photoshop中的直方圖測量間距大小，表示不同組細胞發生遷移的距離。將對照組遷移距離大小設為100%，實驗組遷移比例為：（實驗組遷移距離-對照組遷移距離）/對照組遷移距離×100%。數據分析后作圖。

1.5Transwell實驗檢測rhIL-11對A549細胞侵襲能力的影響取對數生長期的細胞。終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1～2遍，再用無血清培養基重懸，徹底去除血清干擾，調整細胞密度1×105個。在孔徑為8 μm Transwell小室里加入制備好的細胞懸液，同時加入不同濃度的rhIL-11（10、40、80 μg /L）處理，小室內液體總體積為200 μL。24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養基。將Transwell小室放入24孔板中。將帶有小室的24孔板置于37℃，5%CO2培養箱中培養，24h后取出，固定，0.1%結晶紫染色，正置顯微鏡100倍鏡下拍照，數據分析后作圖。

1.6Western blot檢測MMP-2、MMP-9表達水平A549細胞用不同濃度的rhIL-11（0、10、40、80 μg /L）處理24h后，用PBS洗3次，收集細胞并抽提蛋白，12 000 r/min，4℃離心20min，取上清蛋白液，用BCA蛋白定量試劑盒定量。取25 μg蛋白加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸10min，10% SDS-PAGE電泳分離，260mA轉膜90min，5%牛奶室溫封閉1h，TBST洗膜5min×6次，加入MMP-2（1∶500），MMP-9（1∶500）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜5min×6次，加HPR標記二抗（1∶5 000）室溫1h，TBST洗膜5min×6次。以GAPDH為內參對照，實驗重復3次。

1.7統計學方法使用SPSS 18.0軟件完成統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析及重復測量資料的方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1rhIl-11對A549細胞增殖的作用不同濃度、不同時間的rhIL-11組處理后均對A549細胞增殖無明顯影響，差異無統計學意義，見表1。

Tab.1　Effects of different times and different concentrations of rhIL-11 on proliferation of A549 cells表1　不同濃度rhIL-11作用不同時間對A549細胞增殖的影響　（n=6，±s）

Tab.1　Effects of different times and different concentrations of rhIL-11 on proliferation of A549 cells表1　不同濃度rhIL-11作用不同時間對A549細胞增殖的影響　（n=6，±s）

F分組=1.151，F時間=3.243，F交互=2.469，均P>0.05

組別0 μg/L 10 μg/L 20 μg/L 50 μg/L 100 μg/L 24h 0.48±0.01 0.49±0.01 0.50±0.01 0.51±0.00 0.51±0.01 48h 0.65±0.01 0.64±0.01 0.63±0.02 0.69±0.01 0.71±0.00 72h 0.85±0.01 0.84±0.01 0.82±0.02 0.80±0.00 0.79±0.00

2.2rhIL-11對A549遷移及侵襲能力有促進作用

2.2.1劃痕實驗細胞劃痕后，用不同濃度0、10、40、80 μg/L rhIL-11處理A549細胞24h后，100倍倒置顯微鏡鏡下觀察細胞劃痕愈合情況，見圖1。不同濃度rhIL-11作用24h后A549細胞的遷移率明顯上升（P < 0.05），見表2。

a、b、c、d分別表示rhIL-11濃度為0、10、40、80 μg/L；上、下圖分別為不同濃度的rhIL-11作用0、24hFig.1　Effects of different concentrations of rhIL-11 onmigration of A549 cells（×100）圖1　不同濃度rhIL-11對A549細胞遷移能力的影響（×100）

Tab.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells表2　不同濃度rhIL-11對A549細胞遷移及侵襲能力的影響　（n=6，±s）

Tab.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells表2　不同濃度rhIL-11對A549細胞遷移及侵襲能力的影響　（n=6，±s）

＊＊P < 0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P < 0.05；表3同

組別0 μg/L組（1）10 μg/L組（2）40 μg/L組（3）80 μg/L組（4）F細胞遷移率（%）19.94±0.44 24.83±0.54a35.91±0.61ab56.71±0.75abc60.453＊＊侵襲細胞數（個）117.75±15.71 164.39±13.14a192.83±17.44ab293.62±3.13abc236.961＊＊

2.2.2Transwell侵襲實驗A549細胞在Transwell小室內經不同濃度rhIL-11處理24h后，侵襲能力明顯增強，并呈現濃度依賴性（P<0.05），見表2、圖2。

Fig.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells圖2　不同濃度rhIL-11對A549細胞侵襲能力的影響（結晶紫，×100）

2.3rhIL-11對侵襲相關蛋白表達的影響經不同濃度rhIL-11作用24h后，A549細胞MMP-9和MMP-2表達均上調，且呈現濃度依賴性（P＜0.05），見表3、圖3。

3　討論

IL-11是細胞因子IL-6家族中的一員，與IL-6共用GP130信號轉導受體亞單位[2]，是骨髓基質細胞分泌的一種多功能造血調控因子，對造血細胞尤其是巨核細胞具有重要的調控作用，對神經細胞、脂肪細胞及小腸腺窩絨毛干細胞等非造血細胞亦具有明顯的生物活性，在骨髓造血調控中發揮重要作用。有研究證明，外源性IL-11可有效地促進各種原因所致血小板減少癥的恢復[3-4]。然而，近期研究顯示，IL-11過表達與腫瘤的發生發展和轉移有關[5-7]。

Tab.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells表3　不同濃度rhIL-11對A549細胞MMP-9和MMP-2表達的影響　（n=6,%,±s）

Tab.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells表3　不同濃度rhIL-11對A549細胞MMP-9和MMP-2表達的影響　（n=6,%,±s）

組別0 μg/L組（1）10 μg/L組（2）40 μg/L組（3）80 μg/L組（4）FmMP-9 24.12±0.00 38.54±0.00a43.71±0.01ab53.04±0.00abc55.471＊＊MMP-2 13.63±0.00 18.92±0.00a24.32±0.00ab28.92±0.00abc28.567＊＊

Fig.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells圖3　不同濃度rhIL-11對A549細胞MMP-9和MMP-2表達的影響

有研究者發現外源性IL-11對胃癌細胞并無明顯促增殖作用，但對腫瘤細胞的增殖能力可能有潛在的促進作用[8]。本研究結果則發現rhIL-11對A549細胞的增殖能力無明顯影響。此結果與上述研究結果不符，是否與瘤種不同有關，或者與長時間、高濃度的rhIL-11作用有關，有待于進一步研究證實。本研究結果表明，外源性IL-11對A549細胞的遷移和侵襲能力有促進作用，這一作用亦在分子水平上得以證實，在外源性IL-11的作用下，與腫瘤細胞侵襲轉移相關的MMP-2和MMP-9蛋白表達量增加，并呈現一定的濃度依賴效應。MMP-2 和MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，Ⅳ型膠原酶對腫瘤細胞向外擴散和轉移極為重要。國內外實驗研究結果證實，MMP-2和MMP-9與肺癌的發生、發展、浸潤、轉移和預后密切相關[9-10]。腫瘤侵襲和轉移的機制非常復雜，可能通過多條通路實現，很多與腫瘤侵襲和轉移有關的通路的激活都涉及到MMP-2和MMP-9的異常表達[11-12]。另外，在很多研究中，抑制MMP-2和MMP-9的表達可明顯抑制腫瘤的侵襲和轉移[13- 15]。本研究顯示rhIL-11對MMP-2和MMP-9的蛋白表達有顯著的上調作用，提示外源性IL-11對肺癌A549細胞的侵襲和遷移能力有顯著的增強作用。

本研究結果顯示，外源性IL-11對A549細胞的遷移和侵襲能力有顯著的促進作用。但臨床上使用rhIL-11是否促使腫瘤浸潤轉移，有待于臨床隨機對照研究證實。

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（2015-06-24收稿2015-09-17修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of recombinanthuman interleukin 11(rhIL-11) on proliferation,migration and invasion of pulmonary adenocarcinoma A549 cells

XIAO Rong, KANGmafei△, LUOmeiqing, DONG Cuimei, LIU Xiuli
Department ofmedical Oncology, the Affiliatedhospital of Guilinmedical College, Guilin 541001, China
△Corresponding Author E-mail: kmfgl@163.com

Abstract:Objective To observe the effects of recombinanthuman interleukin 11(rhIL-11) on proliferation,migration and invasion of A549 cells, and themechanism thereof.Methods Final concentrations of 0, 10, 20, 50 and 100 μg/L rhIL-11 were added into pulmonary adenocarcinoma A549 cells.The cell proliferation was detected bymTT.The wound-healing, transwellmigration assay were used to validate the capability of themigration and invasion of A549 cells.Matrixmetallopro?teinases (MMP)-2 andmMP-9 protein expressions were revealed by Western blot assay.Results The proliferation of A549 cells was not significantly changed by rhIL-11.The cell capability tomigrate and invade was significantly increased 24h af?ter treatment with rhIL-11 (P < 0.05).The expression levels ofmMP-2 andmMP-9 were significantly un-regulated, and which were increased with the increased concentrations of rhIL-11 (P < 0.05).ConclusionrhIL-11 can promote themigra?tion and invasion of A549 cells, and the up-regulation ofmMP-2 andmMP-9 expressionmight be one of themechanisms.

Key words:interleukin-11; carcinoma, non-small-cell lung; cellmigration assays; neoplasm invasiveness;matrixme?talloproteinase 2;matrixmetalloproteinase 9; rhIL-11

通訊作者△E-mail:kmfgl@163.com

作者簡介：肖榮（1990），女，碩士研究生，主要從事腫瘤的基礎與臨床研究

基金項目：桂林市科技攻關項目（20150126-1-2）

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/51942

作者單位：桂林醫學院附屬醫院腫瘤內科（郵編541001）