α1-腎上腺素受體在前列腺Cajal間質細胞上的表達及意義

馬路平，王勤章,王江平，錢彪，李應龍，李強，倪釗，王新敏

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α1-腎上腺素受體在前列腺Cajal間質細胞上的表達及意義

馬路平，王勤章△,王江平，錢彪，李應龍，李強，倪釗，王新敏

摘要:目的觀察α1-腎上腺素受體在豚鼠前列腺Cajal間質細胞（ICCs）上的表達，并探討其生理意義。方法取豚鼠前列腺組織冰凍切片以及體外培養的豚鼠前列腺細胞，使用c-Kit標記ICCs，α肌動蛋白（α-actin）標記平滑肌細胞，分別進行c-Kit與α1-腎上腺素受體、α-actin與α1-腎上腺素受體配對的免疫熒光雙標記染色。結果豚鼠前列腺組織及分離培養的c-Kit陽性ICCs細胞膜和細胞漿中均表達α1腎上腺素受體，同時α-actin陽性平滑肌細胞上也有α1-腎上腺素受體表達，但在組織切片中ICCs上α1腎上腺素受體的表達顯著強于平滑肌細胞。結論表達α1-腎上腺素受體的前列腺ICCs作為交感神經的功能靶細胞在前列腺平滑肌活動調控中可能發揮重要的作用。

關鍵詞:Cajal間質細胞；α1-腎上腺素受體；交感神經；前列腺；豚鼠

前列腺平滑肌的異常興奮致前列腺內的壓力升高會不同程度地破壞排尿、生殖等生理功能。傳統的觀點認為交感神經神經纖維通過釋放神經遞質作用于平滑肌，從而調節平滑肌的活動，即形成“神經-平滑肌”功能單位[1]。本課題組前期研究發現，前列腺中一種特殊的Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal, ICCs）與前列腺交感神經及平滑肌存在密切的形態聯系[2]，在電鏡下可見前列腺內神經末梢與ICCs之間存在突觸樣連接，推測可能存在“神經-ICCs-平滑肌”功能單位，ICCs在其中發揮介導交感神經信號、調節平滑肌興奮性的作用[3]。在前列腺中，平滑肌的收縮主要依賴于交感神經支配的α1-腎上腺素受體[4-5]。那么作為交感神經末梢對應的突觸后膜，前列腺ICCs上是否存在α1-腎上腺素受體，從而通過α1-腎上腺素受體調節平滑肌的收縮呢？目前尚缺乏明確證據。本研究旨在探討α1-腎上腺素受體在前列腺ICCs上的表達及意義。

1　材料與方法

1.1材料2月齡荷蘭種普通級雄性豚鼠30只，體質量300～400 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心。青鏈霉素、胰蛋白酶（HyClone公司），膠原酶V、PBS（Sigma公司），胎牛血清(Biological Industries)，DMEM(Gibco公司)，干細胞刺激因子（SCF）、6孔板、細胞爬片、無鈣Hank′s溶液（Boster公司），水合氯醛、丙酮、大鼠抗c-Kit抗體（Millipore，美國），兔抗α1-腎上腺素受體抗體（Abcam，美國），小鼠抗α肌動蛋白（α-ac?tin）抗體（Santa Cruz，美國），FITC標記的山羊抗大鼠抗體、FITC標記的山羊抗小鼠抗體、TRITC標記的山羊抗兔抗體（北京中杉金橋）。超凈臺(AIR TECH)，培養箱(Thermo)，離心機(上海安亭科學儀器廠)，倒置顯微鏡（OLYMPUS），激光共聚焦顯微鏡(ZEISS)。

1.2方法

1.2.1豚鼠前列腺標本取材水合氯醛（0.3mL/100 g）腹腔注射，麻醉豚鼠至尿道括約肌松弛排空尿液。將豚鼠固定至操作臺上，組織剪沿下腹正中切口依次剪開皮膚、皮下、腹膜、恥骨聯合，將陰莖提起，沿陰莖背側仔細游離陰莖、后尿道直至充分暴露前列腺背側葉，沿膀胱頸順行快速仔細游離前列腺，避免損傷膀胱及后尿道，以免污染前列腺組織。

1.2.2組織免疫熒光雙重標記取新鮮豚鼠前列腺標本，經OTC包埋，采用恒冷冰凍切片機切片，厚度均為20 μm。將切片置于4℃冷丙酮中固定15min；0.03%醫用雙氧水封閉內源性過氧化物酶20min；10%胎牛血清封閉60min，棄去封閉液；將上述組織切片分為2組，分別加入大鼠抗c-Kit （1∶200）和兔抗α1-腎上腺素受體抗體（1∶200）、兔抗α1-腎上腺素受體抗體（1∶200）和小鼠抗α-actin抗體（1∶100）的混合液，4℃孵育過夜（12～20h）；再次分別加入FITC標記的山羊抗大鼠抗體（1∶100）和TRITC標記的山羊抗兔抗體（1∶100）、FITC標記的山羊抗小鼠抗體（1∶100）和TRITC標記的山羊抗兔抗體（1∶100）；以上各步驟間均1×PBS漂洗3×5min。甘油封片后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。FITC激發波長為488 nm，TRITC激發波長為543 nm，所有拍攝圖片均用Zeiss LSM進行處理。

1.2.3豚鼠前列腺ICCs體外培養取豚鼠前列腺組織，將組織置于1×PBS中清洗2遍，眼科剪迅速將新鮮前列腺組織剪成1mm3大小組織塊，將組織塊置于無鈣Hank′s溶液浸泡15min，傾棄無鈣Hank′s液，加入胰蛋白酶，37℃溫箱消化30min。離心5min (1 000 r/min)，棄上清，加入37℃含1 g/L膠原酶V的無鈣的Hank′s溶液中消化50min，加入含10%胎牛血清DMEM液終止消化（1∶2），過濾、離心后將細胞種植于已放置細胞爬片的6孔板中，每孔含有50 μg/L SCF、15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 2mL。將6孔板移至37℃、5%CO2培養箱中培養24h，換液，將未貼壁的平滑肌細胞及雜質去除，其余貼壁細胞繼續培養，每間隔24～36h換液1次，并置于倒置顯微鏡下觀察，直至可清晰看見紡錘形或星形ICCs。

1.2.4細胞免疫熒光雙重標記將上述培養的細胞爬片取出，將其分為2組，分別加入大鼠抗c-Kit（1∶200）和兔抗α1-腎上腺素受體抗體（1∶200）、兔抗α1-腎上腺素受體抗體（1∶200）和小鼠抗α-actin抗體（1∶100）的混合液，4℃孵育過夜（12～20h）；再次分別加入FITC標記的山羊抗大鼠抗體（1∶100）和TRITC標記的山羊抗兔抗體（1∶100）、FITC標記的山羊抗小鼠抗體（1∶100）和TRITC標記的山羊抗兔抗體（1∶100）；具體步驟同1.2.2。甘油封片后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2　結果

2.1組織免疫熒光雙重標記c-Kit與α1-腎上腺素受體在ICCs上染色均陽性，且ICCs上α1-腎上腺素受體染色明顯較平滑肌中染色深，平滑肌細胞α1-腎上腺素受體染色陽性，見圖1。

2.2細胞免疫熒光雙重標記倒置顯微鏡下可見體外培養的豚鼠前列腺ICCs較前列腺平滑肌細胞小，呈紡錘形或星形，細胞周圍有多個突起，細胞借突起呈網狀分布或與平滑肌連接，具有消化道、膀胱、陰莖海綿體ICCs的典型形態，見圖2；共聚焦顯微鏡下可見c-Kit與α1-腎上腺素受體在體外培養的ICCs上染色陽性，見圖3；α1-腎上腺素受體與αactin在體外培養的豚鼠前列腺平滑肌細胞上染色陽性，見圖4。

Fig.2　Cultured ICCs (white arrows) and smoothmuscle cells (red arrows) from guinea pig prostate under invertedmicroscope（×200）圖2　倒置顯微鏡豚鼠前列腺ICCs（白色箭頭）與平滑肌（紅色箭頭）的混合培養（×200）

3　討論

繼在胃腸道發現ICCs之后，研究發現在人及豚鼠的前列腺中也存在一種形態和功能類似的細胞，稱之為前列腺ICCs[6-8]。本實驗通過體外培養和細胞切片所得的前列腺ICCs，在倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下觀察可見其形態呈紡錘形，分布于平滑肌之間，細胞核明顯，細胞借周圍較長的突起與ICCs或平滑肌細胞連接，呈網狀分布，與典型的ICCs形態及分布情況一致[8]。目前鑒定ICCs的金標準為c-Kit抗體[9]。本實驗所培養的前列腺細胞經c-Kit抗體染色呈陽性，可明確為前列腺ICCs，為本實驗奠定了堅實可靠的基礎。

在胃腸道中，交感神經末梢與ICCs之間依靠突觸樣連接傳遞神經信號，ICCs與平滑肌之間依靠縫隙連接傳遞神經信號，ICCs以此作為交感神經與平滑肌的信號中轉站，調控平滑肌的活動，即形成“神經-ICCs-平滑肌”功能單位[10-13]。本實驗前期電鏡結果發現，前列腺中ICCs和交感神經末梢也存在典型突觸樣連接[4]，ICCs上存在大量縫隙連接蛋白CX43，并與平滑肌連接緊密[3]，故筆者認為在前列腺中也可能存在“神經-ICCs-平滑肌”功能原件。

去甲腎上腺素（NE）是前列腺組織中主要的興奮性神經遞質，在前列腺中，NE主要依賴α1-腎上腺素受體的作用來誘發前列腺平滑肌收縮[4-5]。本實驗通過組織免疫熒光染色及細胞免疫熒光染色兩個不同層面發現前列腺ICCs細胞膜上可以表達α1-腎上腺素受體，提示ICCs是交感神經的靶細胞，結合一般形態和電鏡結果以及α1-腎上腺素受體在前列腺上的功能，說明ICCs通過α1腎上腺素受體接受交感神經信號調控“神經-ICCs-平滑肌”功能原件，從而調控前列腺平滑肌的活動。

此外，本課題組前期研究顯示，交感神經末梢與ICCs的距離明顯小于交感神經末梢與平滑肌之間的距離[4]。結合本實驗發現在ICCs上α1-腎上腺素受體表達明顯高于平滑肌這一結果，筆者認為前列腺中“交感神經-ICCs-平滑肌”這一功能單位通過突觸連接與縫隙連接串聯形式傳遞神經信號較“交感神經-平滑肌”傳遞神經信號快，參與平滑肌張力的快速調節，即有可能參與調節射精過程，而“交感神經-平滑肌”這一功能單位通過相對較慢的神經信號傳遞參與平滑肌張力的慢速調節，可能與維持后尿道壓力及控尿機制有關，具體機制及證據有待進一步研究。

（圖1、3、4見插頁）

參考文獻

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（2015-08-11收稿2015-08-26修回）

（本文編輯陳麗潔）

The expression and significance of α1-adrenoceptor in the interstitial cells of Cajal

MA Luping, WANG Qinzhang△, WANG Jiangping, QIAN Biao, LI Yinglong, LI Qiang, NI Zhao, WANG Xinmin
Department of Urology, the First Affiliatedhospital of Shihezi University, Shihezi 832000, China
△Corresponding Author E-mail:wqz1969@sina.com

Abstract:Objective To observe the expression of α1-adrenoceptor in the interstitial cells of Cajal in guinea pig pros?tate, and explore it,s possible physiological function.Methods The guinea pig prostate slices and cells were cultured.c-Kit was used to distinguish ICCs，and α-actin was used to label smoothmuscle cells.c-kit and α-actin were respectively dou?ble- labeld with α1-adrenoceptor immunohistochemistry.Results Immunohistochemistry showed that c-kit and α1-adre?noceptor were coexpressed in ICCs of c-kit positive guinea pig prostate slices.And α1-adrenoceptor was expressed in α-ac?tin positive smoothmuscle cells.The α1-adrenoceptor wasmorehighly expressed in ICCs than that around smoothmuscle cells in guinea pig prostate slices.ConclusionThe ICCs that express α1-adrenoceptor are the target cells of sympathetic nerve andmight play an important role in adjusting the activity of smoothmuscle cells in guinea pig prostate.

Key words:interstitial cells of Cajal;α1-adrenoceptor; sympathetic nerve; prostate; guinea pig

通訊作者△E-mail:wqz1969@sina.com

作者簡介：馬路平（1986），男，碩士在讀，主要從事泌尿外科學的臨床研究

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81360120）；石河子大學優秀青年-聯合資助項目（2013ZRKXYQ-YD15）

中圖分類號：R329

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150094

作者單位：石河子大學第一附屬醫院泌尿外科（郵編832000）