人參皂苷對波動性高血糖大鼠腎臟Nrf2/ARE信號通路的影響*

王 丹，黃 琦

（1．浙江中醫藥大學，杭州 310053；2．浙江省中醫院，杭州 310000）

·實驗研究·

人參皂苷對波動性高血糖大鼠腎臟Nrf2/ARE信號通路的影響*

王 丹1，黃 琦2

（1．浙江中醫藥大學，杭州 310053；2．浙江省中醫院，杭州 310000）

[目的]探討人參皂苷對波動性高血糖大鼠腎臟氧化應激及轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）/應答元件（ARE）信號通路的影響。[方法]實驗以32只雄性SD大鼠為研究對象，分為正常對照組（NC組，n=8只）和波動性高糖模型組（n=24只），高脂飼料喂養模型組2周后，鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg腹腔注射誘導建立糖尿病大鼠模型，錯時注射葡萄糖和胰島素，建立血糖波動組模型，2周后，將波動性高糖模型組隨機分為3組，分別為波動性高血糖組（FHG組，n=8），人參皂苷低劑量組（LG組，n=8），人參皂苷高劑量組（HG組，n=8）。予人參皂苷低高劑量[14、56 mg/（kg·d）]干預相對應的模型組8周后，切取腎臟組織，用蛋白免疫切跡方法（Western blot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測血紅素加氧酶-1（HO-1）、Nrf2、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）蛋白及mRNA表達。[結果]與NC組相比，FHG組Nrf2的蛋白及mRNA的表達明顯增加（P＜0．05），而HO-1、γ-GCS的表達明顯降低（P＜0．05）；但人參皂苷治療后，LG組及HG組HO-1、γ-GCS、和Nrf2蛋白及mRNA表達明顯增高（P＜0．05）。[結論]人參皂苷能夠進一步促進波動性高糖狀態下Nrf2下游HO-1、γ-GCS蛋白及mRNA表達，增加抗氧化蛋白的含量，提高機體的抗氧化應激能力，對波動性高糖所致的腎臟損傷有一定的保護作用。

人參皂苷；Nrf2/ARE信號通路；波動性高血糖；血紅素加氧酶-1；γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

糖尿病腎病是糖尿病患者常見的微血管并發癥，同時也是致死的主要原因，高血糖導致的腎臟細胞凋亡參與了糖尿病腎病的發生發展[1]。近年來研究發現波動性高血糖較穩定性高血糖對糖尿病患者腎臟的危害性更大[2]。長期暴露于高糖環境中使腎臟組織發生各種代謝變化，負反饋調節上游的調控因子，抵消部分糖毒性，而波動性高糖可能削弱這種適應能力，使糖毒性更加明顯。研究認為，轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）/應答元件（ARE）信號通路可減少高糖環境下活性氧的產生，發揮其抗氧化應激損傷作用[3]，在糖尿病并發血管病變的防治中發揮重要作用。隨著研究的不斷深入，中藥在抗氧化應激中具有獨特優勢[4]。現代藥理學研究認為，人參皂苷作為人參的提取物，具有抗氧化及清除自由基的作用。血紅素加氧酶-1（HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是Nrf2/ARE信號通路調節的抗氧化蛋白，建立波動性高血糖大鼠模型并用傳統中藥人參皂苷進行干預，研究Nrf2/ARE下游基因HO-1，γ-GCS的表達，以探討在防治糖尿病腎臟病變中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 人參皂苷粉末（浙江省中醫院自制，制劑批準號：201308190），超短效胰島素諾和銳（丹麥諾和銳），鏈尿佐菌素（STZ），（Sigma公司），自制高脂飼料：蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0．5%、基礎飼料69．5%；HO-1、γ-GCS、Nrf2引物（Takara公司），兔抗HO-1多克隆抗體、兔抗γ-GCS多克隆抗體和兔抗Nrf2多克隆抗體（CST公司），RT-PCR反應試劑盒（TaKaRa公司），Trizol裂解液（Invitrogen公司）。

1.2 主要儀器 血糖試紙及血糖儀（德國羅氏），Step one plus PCR儀（美國生物應用系統公司）。

1.3 動物 6～8周齡SD雄性大鼠32只，體質量160～180 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供[SCXK（滬）2008-0016]。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12 h明暗交替，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心[SYXK（浙）2008-0115]。

1.4 糖尿病模型制備 正常對照組（NC組n=8）予普通飼料喂養；糖尿病模型組（n=24）予高脂飼料喂養2周，所有大鼠禁食不禁水16 h，糖尿病模型組用小劑量STZ 35 mg/kg腹腔注射誘導建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，禁食不禁水16 h，測空腹血糖15～20 mmol/L為模型制作成功。

1.5 血糖波動模型制備 將糖尿病模型組定時給予腹腔注射250 g/L葡萄糖溶液0．375 g/（kg·d），錯時30 min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳，造成1 d中血糖值大幅度波動模型，使其血糖值在高血糖和低血糖間反復漂移，注射后30 min測血糖，2周后，將波動性高糖模型組按隨機數字表法隨機分為3組，分別為波動性高血糖組（FHG組，n= 8），人參皂苷低劑量組（LG組，n=8）、人參皂苷高劑量組（HG組，n=8）。治療組分別予人參皂苷[14、56 mg/（kg·d）]灌胃，正常對照組及波動性高糖組予等量生理鹽水灌胃8周作對照，每日2次。

1.6 標本采集 每周用血糖儀測尾尖血血糖，稱其體質量，并計算水和食物的攝入量。至實驗結束，大鼠禁食12 h，切取腎臟組織，放入液氮罐中保存，用于蛋白免疫切跡方法（Western blot）及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測。

1.7 Western blot檢測HO-1、Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平 從液氮罐中取出腎臟組織，放入液氮預冷過的研缽中，加入蛋白酶抑制劑+裂解液（1∶100）適量，研磨至液體澄清；吸取全部液體放入離心管中，12 000 r/min，4℃，離心15 min，提取細胞總蛋白；采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；吸取蛋白樣品，以60 V電壓電泳，當條帶跑至分離膠和濃縮膠分界面時改為90 V電泳，時間2～4 h；聚偏二氟乙烯（PVDF）轉膜（250 MA，2．5 h）；將PVDE膜浸于封閉液中，4℃封閉過夜；取出膜，與一抗接觸，室溫旋轉孵育2～3 h，用洗膜緩沖液（TBST）沖洗3次，同樣的方法二抗室溫孵育1～2 h后，TBST洗3次；加入增強化學發光法（ECL）試劑，將PVDF膜放在Chemi Doc XRS上采集圖像。

1.8 RT-PCR檢測HO-1、NRF2、γ-GCS mRNA表達 由基因庫查的所需mRNA的核苷酸序列，PrimerPremier計算機軟件輔助引物設計，引物由TakaRa公司設計并合成。HO-1上下游引物分別為：5’-GGAACTTTCAGAAGGGCCAGGT-3′和5’-TGCAGCTCTTCTGGGAAGTAGACA-3′,γ-GCS上下游引物分別為：5’-TGTAGTGCGAGGAAGAGGTATGA-3′和5’-GGAGGGAAAGGAGAGGAAGG-3′,NRF2上下游引物分別為：5’-ATTGTGCTTGTGAGGGTGTTTC-3′和5’-CCCTTCCTGTCTTTTCTTCTCTCT-3′。從液氮中取出腎臟組織冰上迅速研碎后，用Trizol法提取總RNA；吸取1μL抽提的RNA在Nanodropl000上進行RNA濃度測定，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性；取RNA按照逆轉錄體系逆轉錄為cDNA；取cDNA 2μL及HO-1、γ-GCS上下游引物各0．4 μL，SYBRPremix Ex TaqTM（2×）10 μL，Rox Reference Dye II（50×）0．4μL，滅菌雙蒸水6．8μL（擴增條件為：95℃、5 min，94℃、1 min，1 min，72℃、1 min，32個循環后，72℃、8min。2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后置于Bio-Rad Gel凝膠圖像分析系統進行吸光度掃描分析，以GAPDH作為內參照，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值分析目的基因的相對表達水平。）

1.9 統計學分析 采用SPSS 18．0統計軟件，數據均采用均數±標準差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較如果方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhane’sT2。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷對HO-1、Nrf2和γ-GCS蛋白的表達 Westernblot結果顯示，與NC組相比，FHG組Nrf2蛋白表達增高（P＜0．05），HO-1、γ-GCS蛋白表達下降（P＜0．05）；與FHG組相比，LG組及HG組HO-1、γ-GCS和Nrf2蛋白表達均明顯增高（P＜0．05）。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腎臟HO-1、Nrf2及γ-GCS蛋白的表達

2.2 人參皂苷對HO-1、Nrf2和γ-GCS mRNA的表達 RT-PCR結果顯示，與NC組相比，FHG組Nrf2 mRNA表達增高（P＜0．05），HO-1、γ-GCS mRNA表達下降（P＜0．05）；與FHG組相比，LG組及HG組HO-1、Nrf2和γ-GCS mRNA表達均明顯增高（P＜0．05），見表1、圖3。

圖2 各組大鼠腎臟HO-1、Nrf2及γ-GCS蛋白表達的相對含量

表1 各組大鼠HO-1、Nrf2、γ-GCS mRNA的表達量(s)

表1 各組大鼠HO-1、Nrf2、γ-GCS mRNA的表達量(s)

注：與NC組相比，*P＜0．05；與FHG組相比，#P＜0．05。

組別 n HO-1 Nrf2 γ-GCS NC組 8 0．65±0．04 0．42±0．06 0．64±0．03 FHG組 8 0．47±0．04* 0．63±0．03* 0．53±0．05* LH組 8 1．13±0．12#0．83±0．04#1．24±0．03#HG組 8 1．46±0．08#1．04±0．12#1．48±0．07#

圖3 HO-1、Nrf2、γ-GCS mRNA表達水平

3 討論

氧化應激是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，活性氧簇（ROS）的產生與抗氧化防御系統的清除失衡，導致機體組織細胞及蛋白的損傷。ROS在糖尿病發展過程中起關鍵作用[5]，在高糖狀態下，蛋白激酶C活性增強，多元醇途徑、己糖胺通路、晚期糖基化終末產物途徑等旁路代謝過度激活，這些不同代謝途徑引起細胞內煙酰胺嘌呤二核甘磷酸（NADPH）氧化產生的ROS，可致體內氧自由基大幅增加并產生過氧化反應，同時使機體的抗氧化防御能力出現下降趨勢，因此在機體內表現為氧化能力大大超過了抗氧化能力，從而誘導細胞內發生氧化應激反應[6]。研究表明，氧化應激是糖尿病發展的重要機制[7]，Forbes Josephine等[8]研究認為氧化應激是糖尿病腎病發生的主要原因。其通過線粒體電子傳遞鏈、葡萄糖自氧化和多元醇等途徑，使ROS含量增加。Chang等[9]研究發現，急性和慢性血糖波動均可增加2型糖尿病患者氧化應激和慢性炎癥反應。波動性高血糖較穩定性高血糖刺激機體產生較多ROS，抗氧化能力下降，導致內皮細胞功能紊亂。氧化應激參與波動性高糖誘導的腎小管上皮細胞的凋亡[10]，Nrf2/ARE信號通路可通過調控下游基因的表達，提高機體的抗氧化應激能力，延緩糖尿病并發癥的發生。

應答元件（ARE）是一個特異的DNA啟動子結合序列，是II相解毒酶和細胞保護蛋白基因表達的上游調節區，Nrf2是這一序列的激活因子。活化的Nrf2從Keap1（Kelchlike Echassociated protein-1）解離后進入細胞核，與細胞核內小Maf蛋白（small Maf proteins）結合成異二聚體后與ARE序列結合，進而啟動受ARE調控的基因的轉錄，稱為Keap1-Nrf2-ARE通路。Nrf2/ARE是一種重要的抗氧化應激通路[11]。研究表明，該信號通路可延緩糖尿病的發展，預防糖尿病并發癥的發生，在維持血糖平衡和抑制糖尿病發生的過程中發揮了重要的作用[12-13]。氧化與抗氧化系統相互拮抗平衡，人體才能正常發揮其有效的生理功能，如果ROS產生過多，各種抗氧化物質如HO-1，谷胱甘肽（GSH）等的含量下降，抗氧化能力降低，不能有效的清除自由基，就會發生氧化應激損傷。Nrf2/ARE信號通路可降低高糖環境下活性氧的產生，機體細胞受到ROS信號作用，Nrf2從Keap-1中解離，通過與ARE結合，并參與下游II相代謝酶基因和抗氧化基因的轉錄，包括HO-1、γ-GCS[14]。γ-GCS、HO-1能夠啟動氧化應激系統，清除體內自由基，從而起到保護細胞的作用。Yap等[15]研究發現，山楂酸通過激活Nrf2/ARE通路，上調HO-1和醌氧化還原酶（NQO1）的表達，其機制可能是增強了Nrf2蛋白的穩定性，減少Keap-1的表達，引起Nrf2在核內的累積，進而與下游靶基因ARE結合有關。實驗研究發現，FHG組Nrf2蛋白及mRNA表達明顯高于NC組，說明在生理狀態下，其表達量較低，但在引起氧化應激的因素誘導下如波動性高血糖、缺氧、血紅素等，均可誘導其顯著表達。波動性糖尿病大鼠腎臟中出現了氧化應激，激活了Nrf2蛋白及mRNA表達，但FHG組HO-1、γ-GCS蛋白及mRNA的表達明顯低于NC組，這可能是由于波動性高血糖氧化應激過強消耗了通過機體自身的Nrf2/ARE信號通路激活而增加的抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS，致使機體內抗氧化蛋白含量降低，氧化與抗氧化系統拮抗失衡，因而氧化應激對波動性高血糖大鼠腎臟的損傷顯著增加。氧化應激損傷的發生，與機體的抗氧化能力下降有關,因此，通過提高機體內抗氧化蛋白的水平，減緩波動性高糖所致的腎臟損傷，對預防糖尿病并發癥的發生有著重要的作用。

隨著社會的不斷發展，傳統中醫中藥在防治糖尿病方面發揮了重要的作用[16-17]。中醫認為，糖尿病屬“消渴”范疇，其病機主要在于陰精虧虛，燥熱偏勝，故以清熱潤燥、養陰生津為治療大法。人參具有“大補元氣、補脾益肺、生津、安神益智”的功效。現代醫學研究表明，人參皂苷是其主要活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、解毒、抑制腫瘤細胞增殖、提高免疫力、降血糖等作用[18-19]。前期研究結果表明[20]，人參皂苷使細胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性增加，丙二醛（MDA）含量降低，有效清除機體內過多的自由基，阻止脂質過氧化物的過度產生，在波動性高血糖環境中增強血管內皮細胞抗氧化和抗凋亡能力。人參皂苷通過改善腎組織中基質金屬蛋白酶-2（2MMP-2）的表達，減少細胞外基質的形成，起到對腎臟的保護性作用[21]。實驗研究發現，人參皂苷治療后，HO-1、γ-GCS、和Nrf2蛋白及mRNA表達明顯高于正常對照組及波動性高血糖組，提示人參皂苷通過促進Nrf2與Keap1解離，使其轉位進入細胞核內，結合抗氧化反應元件ARE，上調HO-1、γ-GCS的表達，抗氧化蛋白含量增加，提高了機體的抗氧化反應能力，這與既往研究結果相一致[22]。人參皂苷具有較強的抗氧化和自由基清除能力，通過調控Nrf2/ARE信號通路，抑制波動性高糖所致的腎臟損傷，在防治糖尿病及其并發癥方面具有確切的臨床療效。

綜上所述，人參皂苷可以減輕波動性高血糖大鼠腎臟的氧化應激損傷，波動性高血糖大鼠的腎臟保護機制其機制可能是通過激動Nrf2/ARE信號通路啟動抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS的轉錄和表達。在臨床上，現有的治療及研究很難從根源上徹底逆轉胰島β細胞功能的障礙和凋亡，因而控制波動性高糖所致氧化應激對腎臟功能的損害，阻滯糖尿病并發癥的發生尤為重要。西醫對此無有效方法及藥物，而傳統中藥可以發揮自身優勢。因此，應該強調平穩降糖，盡量減少血糖的波動，重視波動性高血糖對腎臟組織的損害，及傳統的中藥對延緩糖尿病并發癥的作用。

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Effect of ginsenoside on Nrf2/ARE signaling pathway in the kidney of rats exposed to intermittent high glucose

WANG Dan1,HUANG Qi2
（1.Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China;2.Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310000,China）

[Objective]To observe the effects of ginsenside on Nrf2/ARE signaling pathway in the kidney of diabetic rats exposed to intermittent high glucose．[Methods]Thirty-two male SD rats were randomly divided into normal group(group NC,n=8)and fluctuating hyperglycemia model group(n=24)．The fluctuating hyperglycemia model group established by injection of a small dose of streptozotoein(STZ)after feeding them with high-fat diet for 2 weeks,and by alternative intraperitoneal injection of insulin and glucose．Then they were randomly divided into three groups of FHG(the fluctuating hyperglycemia group),LG(treated with ginseng 14 mg/(kg·d),HG[treated with ginseng 56 mg/(kg·d)]．After 8 weeks HO-1,γ-GCS and NRF2 protein were observed by western blot and HO-1,γ-GCS, NRF2 mRNA were measured by RT-PCR．[Results]Compared with group NC,levels of NRF2 protein and mRNA in FHG groups were significantly decreased(P＜0．05),levels of HO-1,γ-GCS,NRF2 protein and mRNA in FHG groups were significantly increased(P＜0．05);compared with group FHG,levels of HO-1,γ-GCSand NRF2 protein and mRNA in group LG and HG were significantly increased(P＜0．05)．[Conclusion]Ginsenoside could further promote the expression of HO-1,γ-GCS,protein and mRNA in the downstream gene of Nrf2 in the state of intermittent high glucose．Ginsenoside reduce the production of reactive oxygen species and improve the body’s ability to restrain oxidative stress,which has a protective effect on the rat renal injury induced by glucose fluctuation．

ginsenoside;nuclear factor erythroid-2-related factor-2 signaling pathway;fluctuating hyperglycemia;heme oxygenase-1;γ-glutamylcysteine synthethase

R587．1

A

1673-9043（2016）06-0385-05

2016-08-12）

10．11656/j．issn．1673-9043．2016．06．07

浙江省中醫藥管理局基金項目（2014ZA045）。

王 丹（1990-），女，碩士研究生，研究方向為中西醫結合內分泌方向。

黃 琦，E-mail:hq871201@163．com。