蠟樣芽孢桿菌培養條件的優化及其溶藻方式的研究*

李文利 劉征宇 陸雅雅 章忠輝 李曉暉

(上海海洋大學上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306)

水體富營養化導致藍藻水華的爆發日趨頻繁，嚴重破壞了水生生態系統，危及人類和水生生物的健康。常用的除藻方法包括物理法、化學法和生物法[1-2]。物理法除藻最為方便可行，效果也比較顯著，對于緊急處理時有很好的成效，但成本過高，治標不治本；化學法除藻通過向水體中投加化學藥劑，能快速殺死藻細胞，但大多數化學藥劑有毒，易造成二次污染；生物法除藻是目前來說操作最簡單、成本最低、對環境最安全的方法[3-5]。溶藻細菌是一類能通過直接接觸藻細胞或間接分泌胞外代謝產物來抑制藻類生長，甚至溶解藻細胞、殺死藻類的細菌的統稱[6]。溶藻細菌治理藍藻水華是生物除藻的一種方式[7-8]。

本研究從太湖水華水域分離得到一株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，是一種有效的溶藻細菌。在單因素實驗的基礎上，進行響應面實驗設計，通過優化培養溫度、轉速、裝瓶量、接種量、發酵時間等培養條件，并根據實際情況進行調整，得到蠟樣芽孢桿菌的最佳培養條件，從而提高溶藻細菌培養液對銅綠微囊藻905(Microcystisaeruginosa905)的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藻種和菌種

銅綠微囊藻905購自中國科學院野生生物種質庫——淡水藻種庫，轉種到新鮮的BG11培養基后在溫度為25 ℃、光照強度為2 000 lx、光暗比為14 h∶10 h的條件下培養[9]。

蠟樣芽孢桿菌從太湖水華水域分離得到并經鑒定確認。

1.1.2 培養基

蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO40.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.15 g/L、MnSO40.5 g/L，調pH=8.2。

1.1.3 主要儀器

智能型光照培養箱(SPX-250PG)；紫外—可見分光光度計(SQ-UV2300)；光學顯微鏡(奧林巴斯，CX21)；多管架自動平衡離心機(TDZ5-WS)等。

1.2 方 法

1.2.1 溶藻實驗

蠟樣芽孢桿菌經過營養瓊脂活化后接種在新鮮的培養基中，在37 ℃、180 r/min的條件下發酵12 h。發酵液經4 000 r/min離心10 min后，取上清液0.5 mL與對數生長期的銅綠微囊藻905藻液4.5 mL混合，同時取0.5 mL無菌的培養基與生長對數期的銅綠微囊藻905藻液4.5 mL混合后作為對照(T0)，放置在溫度為25 ℃、光照強度為2 000 lx、光暗比為14 h∶10 h的條件下培養5 d。

1.2.2 銅綠微囊藻905生物量的測定

用光學顯微鏡視野計數法測定銅綠微囊藻905的藻細胞濃度[10]。

銅綠微囊藻905中含有葉綠素a，因此在超聲振蕩的條件下使銅綠微囊藻905藻細胞破碎釋放出葉綠素a，也可以用葉綠素a的濃度間接表征銅綠微囊藻905的生物量。葉綠素a的測定方法：用丙酮在低溫黑暗條件下萃取待測培養液12 h后離心，取上清液分別在 630、647、664、750 nm波長下測定吸光度，根據式(1)計算葉綠素a的濃度[11]。

c=11.85(A664-A750)-1.54(A647-A750)-0.08(A630-A750)

(1)

式中，c為葉綠素a的質量濃度，mg/L；A630、A647、A664、A750分別為630、647、664、750 nm波長下的吸光度。

通過清除率來評價蠟樣芽孢桿菌的溶藻效率，計算公式見式(2)。

η=(1-ce/cc)×100%

(2)

式中，η為藻細胞或葉綠素a的清除率，%；ce為實驗組的藻細胞濃度或葉綠素a質量濃度，單位根據實際情況確定；cc為對照組的藻細胞濃度或葉綠素a質量濃度，單位根據實際情況確定。

1.2.3 單因素實驗

將活化好的蠟樣芽孢桿菌接種在250 mL錐形瓶中培養，對培養溫度、轉速、裝瓶量、接種量、發酵時間進行單因素實驗。研究培養溫度對葉綠素a清除率的影響時，控制轉速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、接種量為4%、發酵時間為12 h，培養溫度設置為27、32、37、42、47 ℃；研究轉速對葉綠素a清除率的影響時，控制培養溫度為37 ℃、裝瓶量為50 mL、接種量為4%、發酵時間為12 h，轉速設置為60、100、140、180、220 r/min；研究裝瓶量對葉綠素a清除率的影響時，控制培養溫度為37 ℃、轉速為180 r/min、接種量為4%、發酵時間為12 h，裝瓶量設置為25、50、75、100、125 mL；研究接種量對葉綠素a清除率的影響時，控制培養溫度為37 ℃、轉速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、發酵時間為12 h，接種量設置為2%、4%、6%、8%、10%；研究發酵時間對葉綠素a清除率的影響時，控制培養溫度為37 ℃、轉速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、接種量為4%，發酵時間設置為4、6、8、10、12 h。

1.2.4 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，選擇培養溫度(X1)、轉速(X2)和發酵時間(X3)3個主要因素再進一步采用Box-Behnken中心組合設計進行3因素3水平響應面實驗，綜合考慮因素間的交互作用。利用Design-Export 8.0軟件，根據Box-Behnken中心組合設計原理設計的因素水平表見表1。

表1 因素與水平表

1.2.5 蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式探究

為探討蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式，對其培養液進行如下處理：(1)用 121 ℃、103.4 kPa高溫高壓滅菌20 min，記為T1；(2)用0.2 μm濾膜過濾，記為T2；(3)用12 000 r/min的轉速離心1 min，記為T3；(4) 用250 W超聲振蕩15 min，記為T4；(5)不做任何處理，記為T5。將上述處理的培養液再按照1.2.1的溶藻實驗進行溶藻方式探究[12]。

2 結 果

2.1 蠟樣芽孢桿菌培養條件的單因素優化

蠟樣芽孢桿菌培養條件的單因素優化實驗結果如圖1所示。由圖1(a)可見，37 ℃時蠟樣芽孢桿菌對銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率最高達92.30%，溫度過高或過低都會影響溶藻效果；圖1(b)顯示，轉速為60～180 r/min時，蠟樣芽孢桿菌對銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率隨轉速的升高而升高，180 r/min時葉綠素a清除率達到最高(89.92%)，轉速為220 r/min時葉綠素a清除率反而有所降低；裝瓶量通過影響發酵過程的通氣量而影響蠟樣芽孢桿菌對銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率，圖1(c)結果顯示，當裝瓶量為75 mL時葉綠素a清除率最高(90.53%)；從圖1(d)可以看出，蠟樣芽孢桿菌接種量為2%(體積分數，下同)～6%時，銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率隨接種量增加而升高，當接種量達到6%以后，葉綠素a清除率基本保持不變；圖1(e)為發酵時間對銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率的影響，隨著發酵時間的延長葉綠素a清除率先升高后降低，發酵時間為8 h時葉綠素a清除率最高(91.97%)。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 The results of the single factor experiments

根據單因素實驗結果，蠟樣芽孢桿菌在培養溫度為37 ℃、轉速為180 r/min、裝瓶量為75 mL、接種量為6%、發酵時間為8 h的條件下對葉綠素a的清除率最高。

2.2 響應面實驗設計與結果

響應面實驗設計及相應葉綠素a清除率結果見表2，以葉綠素a清除率(Y)為因變量得到二次回歸方程如式(3)所示，并對各變量的回歸系數進行顯著性分析(見表3)。

(3)

從表4可知，響應面實驗設計得到的回歸模型P<0.000 1，失擬的P=0.681 3，因此回歸模型高度顯著(P≤0.05)，但失擬檢驗不顯著(P>0.05)；蠟樣芽孢桿菌菌株培養條件優化的回歸模型的校正決定系數R2(adj)為0.939 8，說明模型能解釋約93.98%的總變異；決定系數R2為0.968 3，說明模型擬合程度良好，誤差較小，可以用來分析和預測蠟樣芽孢桿菌培養條件的優化情況。

表2 響應面實驗設計及相應葉綠素a清除率結果

表3 回歸系數的顯著性分析

最終，Design-Expert 8.0軟件的預測結果為：培養溫度39.35 ℃，轉速170.40 r/min，發酵時間9.08 h?？紤]到實際條件的可控制性，把最佳培養條件修正為：接種量6%、裝瓶量75 mL、培養溫度39 ℃、轉速170 r/min、發酵時間為9 h，此時葉綠素a清除率為86.72%。

表4 回歸模型的方差分析1)

注：1)模型R2(adj)=0.939 8，R2=0.968 3。

2.3 蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式探究

溶藻方式的探究結果見表5，除T4的藻細胞清除率較低外，T1～T3處理方式與T5幾乎沒有差別，而蠟狀芽孢桿菌耐高溫性較差，經高溫處理后細胞已經失活[13]，由此可以初步判斷蠟狀芽孢桿菌可能通過分泌一種耐高溫的代謝產物或是細胞外物質來抑制銅綠微囊藻905的生長，溶藻方式屬于間接溶藻，超聲振蕩可能會破壞這種代謝產物或細胞外物質。

表5 溶藻方式的研究結果

3 討 論

微囊藻是藍藻水華的優勢藻類，其中以銅綠微囊藻最具代表性，會產生對人體有害的微囊藻毒素[14]。利用溶藻細菌治理藍藻水華已經成為研究的熱點和趨勢。溶藻細菌的溶藻方式分為直接溶藻和間接溶藻[15-16]。直接溶藻是指溶藻細菌與藻細胞直接接觸，通過破壞藻細胞的結構達到溶藻效果；間接溶藻是指溶藻細菌通過分泌代謝產物或細胞外物質來抑制藻類的生長，如抗生素、多肽、蛋白質等。崔亞青等[17]從太湖水域分離得到一株水單胞菌屬的溶藻細菌，菌體無溶藻作用，主要是通過代謝產物達到溶藻的效果，與本研究發現的蠟樣芽胞桿菌的溶藻方式一致，屬于間接溶藻細菌，但其溶藻效果不穩定、溶藻效率較低。微生物生長和代謝與很多因素有關，如培養溫度、發酵時間、接種量等[18]。因此，徐長安等[19]對溶藻細菌的培養溫度、發酵時間、接種量等發酵條件進行了單因素優化實驗，結果發現，發酵條件對溶藻效果影響顯著。許珂等[20]利用單因素實驗和正交實驗對溶藻細菌的發酵條件進行優化，溶藻效率提高了10倍。因此，對溶藻細菌培養條件進行優化是必要的。

4 結 論

蠟樣芽胞桿菌的最佳培養條件為培養溫度39 ℃、轉速170 r/min、裝瓶量75 mL、接種量6%、發酵時間為9 h，葉綠素a清除效率可達86.72%；通過溶藻方式的探究，可以初步判斷蠟樣芽孢桿菌是通過分泌一種耐高溫的代謝產物或是細胞外物質來抑制銅綠微囊藻905生長的，溶藻方式屬于間接溶藻，超聲波處理可能會破壞這種代謝產物或細胞外物質。

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