細胞培養技術方法及避免污染的措施

孫偉（吉林省五星動物保健藥廠，吉林　長春　130062）

細胞培養技術方法及避免污染的措施

孫偉（吉林省五星動物保健藥廠，吉林長春130062）

醫學研究中最具技術含量的研究手段就是細胞培養，同時它還是生物學研究中應用比較廣泛的一種方法。下面本文就細胞培養技術方法進行分析，觀察其操作中引發污染的情況，同時提出幾點避免污染的措施，內容如下。

細胞培養技術；污染；措施

1　細胞培養技術方法分析

1.1細胞原代培養技術

細胞的原代培養是指取樣完成后的第一次培養實驗，它能夠在細胞分化、藥物測試或病毒試驗等方面取得顯著培養效果。其技術的應用首先先對提取的樣品組織進行清洗，然后將其切成較小組織塊，可在1或2mm，再給予分散劑擴大組織塊，時間1小時或半小時，之后進行吹打，并在混勻后利用過濾網濾過，將細胞與細胞團離心出來，放在對應濃度的培養基上，調整好培養箱，溫度在37攝氏度，二氧化碳在5%，將培養基置于培養箱中開始培養實驗，此技術的試驗成功率很高。

1.2細胞傳代培養技術

傳代培養的應用是在離體細胞生長一定時間后，當其發生分裂且增殖逐漸緩慢或要終止生長死亡前，從一個培養瓶按一定比率轉移到另一個培養瓶內繼續培養和生殖的方法，這種方法被稱作傳代培養技術。此技術的應用首先將原舊培養液吸出，取PBS緩沖液對其進行兩次沖洗，然后取胰蛋白酶液滴入其中給予消化處理，之后利用顯微鏡進行查看，待細胞恢復飽滿樣時，將胰酶液吸出后再將新鮮血清培養基加入到瓶中，避免細胞粘壁進行吹打，并將其分裝于培養瓶中培養，保證培養液充分并使細胞均勻浮于上面，之后加強觀察，一旦又出現細胞分裂到一定程度時再給予傳代培養。

1.3細胞凍存技術

細胞的凍存可以有效保證細胞活性和長期保存，一般在～80攝氏度的冷存環境下細胞可儲存一年的時間，若在液氮環境下，～196攝氏度中能夠長期保存，直至使用，也有相關學者表明，長期保存的牙髓成纖維細胞，其使用率及成活率在80%以上。這種凍存技術的操作中，在細胞凍存前應該先對對數細胞進行培養液培養，然后將其去除，再投入消化液、離心，離心后將上清液去除，加入凍存液，待細胞密度適度調整以后，取懸液細胞并分別裝在凍存管中，封閉，明確寫明細胞名稱、代數、凍存時間等，先于4攝氏度存放半小時，再移入～20攝氏度冷箱內凍一小時，之后放在～80攝氏度凍箱內凍存24小時，最后可置于電子技術控制的冰凍箱中長久存儲。

1.4細胞的復蘇技術

細胞復蘇技術的應用主要是對凍存細胞進行復蘇，促使其恢復活性，當凍存管從液氮環境中取出后，馬上放入準備好的37攝氏度水環境中進行快速、反復晃動，晃致凍存液徹底融化為止，然后將融化后的細胞置入離心管內，取4ml培養液漸漸滴入其中，用每分鐘1000轉速度離心，然后在細胞沉淀以后進行密度調整，再行細胞培養。

2　細胞培養中引起污染產生的原因

2.1微生物

微生物在生活環境中是無處不在的，無論是靜止物體，還是人們皮膚表層、動物皮毛等，其表面均存在細菌。而在實驗室進行細胞培養時，如果工作人員對微生物學及相關技術不了解或沒有經過嚴格培訓，其操作中會忽視很多細節，造成微生物污染，如細胞培養使用的培養基、器皿、使用設施、從一處轉移另一處時等，這些操作若不能有效避免，嚴格無菌操作，或在切割時不遵從無菌切開等，均可產生微生物污染。

2.2工作人員

人體是在不斷活動的，在實驗室內工作人員是產生污染的最大來源，細胞培養各種操作都需要工作人員進行，其皮膚鱗屑、活動中帶動空氣或說話時飛沫與口腔內存在的多種微生物等，均可對細胞培養造成污染威脅，而且一旦工作人員攜帶病菌或感染病毒，進入實驗室就是一個高危污染源。同時實驗室的通風口、棚板口、排水口等各種通道也存在不斷產生新污染的危害，像一些水槽、潮濕培養箱等潮濕地方也存在滋生細菌并提供污染的危險。

2.3試劑

細胞培養中試劑的使用同樣存在一定潛在污染概率，購進的試劑及培養基具體的應用要明確，它們有無細菌，具體作用及有無必要進行滅菌等。就如生長因子或血清在培養試驗中，易發生病毒污染，所以說有的試劑原材料購進時未滅菌，而有的培養基，如豬胰蛋白酶，它含有動物病毒，試驗中會導致細胞培養結果的不準確，因此需要對試劑進行風險評估，確定其使用的可靠，減低試劑使用不當引起的污染。

3　避免污染的措施

3.1工作人員和環境

工作人員進實驗室行細胞培養前必須徹底對手、手臂清潔和消毒，穿戴一次性膠手套、無菌外衣、鞋，扎好袖口；細胞培養前將各種用具放于無菌照射下滅菌30min；各操作必須按照無菌操作流程進行；同時細胞培養試驗臺與培養儲存柜、清潔區等要保持較遠距離；定期對潮濕區域檢測，及時給予處理，防止產生污染。

3.2細胞培養的用品和試劑

細胞培養中涉及的各種如試管、過濾器等用品，使用前均進行酒精噴擦，酒精度80%；使用的一次性無菌塑料用品開封后必須單獨存放；試驗中試劑瓶打開后，將蓋口向下置于無菌臺上，關蓋前必須用酒精燈烤后在蓋嚴；試劑的選購嚴格檢驗生產日期、批次等，對一些沒有滅菌的試劑進行評估確定后再使用等。

［1］周麗薇.細胞培養技術與防止細胞污染的方法［J］.醫學信息（上旬刊）.2010（11）.

［2］姜彬.細胞培養技術簡介及避免污染的策略［J］.生物學通報.2008（03）.

［3］史嘉林；楊棟.細胞培養及避免細胞污染的方法［J］.養殖技術顧問.2010（07）.

［4］馬艷南；閻雪瑩；殷悅；蔡麗杰.細胞培養技術及避免污染的方法［J］.黑龍江科技信息.2014（29）.