非對映異構體雜質在合成多肽藥物中的相關探究

潘俊鋒

(深圳翰宇藥業股份有限公司,廣東　深圳　518054)

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非對映異構體雜質在合成多肽藥物中的相關探究

潘俊鋒

(深圳翰宇藥業股份有限公司,廣東深圳518054)

探討非對映異構體雜質在合成多肽藥物中的研究及控制。通過研究合成多肽藥物氨基酸的消旋的作用機制，觀察非對應異構體雜質的產生過程，從合成原料、工藝操作以及檢測方法方面提供合理的質控建議。了解部分氨基酸水解后產生的水解雜質以及消旋產生的非對應異構雜質是合成多肽藥物的重要物質，應加強對非對映異構體雜質的研究與控制。

非對映異構體雜質；多肽藥物；消旋

多肽最初的合成方式為液相合成，但是液相合成的步驟較為復雜，每個環節需要進行單獨的純化及分離，所以在實際操作過程中受到很多限制[1]。美國生物化學家R.Bruce Merrifield于1963年發明了多肽固相合成法，提出用固相樹脂作為載體合成四肽化合物[2]。在隨后的四十幾年里，固相合成法不斷的發展，廣泛應用于蛋白質與多肽的研究中[3]。固相合成法是將于固相載體連接的首個氨基酸作為起點，通過活化、耦合以及脫保護等一系列的循環過程，將保護基進行逐一連接最終形成多肽。除甘氨酸外，大部分的氨基酸為手性分子，因此，在合成過程中會出現消旋化，而消旋的產生會丟失肽分子整體或部分的化學信息，加之多肽類藥物的生物活性與其立體結構有直接關系，所以加強對多肽合成過程中非對應異構體雜質的研究有重要意義[4]。本文通過對多肽藥物合成過程、消旋化的機制以及非對應異構體雜質的控制展開探討，旨在為非對應異構體雜質的研究做出參考。

1　多肽藥物的簡介

1.1多肽藥物的組成

多肽是一種分子結構介于氨基酸與蛋白質之間的化合物，其相對分子量小于10000。多肽類藥物用于治療糖尿病、腫瘤、中樞神經系統疾病、心血管疾病、骨質疏松、肢體肥大、胃腸道疾病、免疫系統疾病以及抗菌中有顯著治療效果。目前全球范圍內經批準上市的多肽藥物約有80種，其中，治療糖尿病類藥物7種、抗腫瘤藥物17種、治療感染與免疫系統疾病16種、治療血管及泌尿系統疾病9種，剩余其他藥物31種。

1.2多肽藥物的來源

目前市場上多肽藥物的獲取途徑主要有3種：(1)通過基因重組多肽;(2)采用化學合成多肽;(3)從生物中進行提取。目前大部分多肽類藥物均為化學合成。

2　多肽藥物的設計與發現

2.1天然活性多肽

從自然存在的生命體中進行提取分離，通過活性測定方法，將具有開發價值的活性多肽篩選出來，是目前研發新藥的模式。多多肽分子參與了許多機體的代謝、生理及病理過程。根據這些自然現象可以發現許多新的多肽物質。例如艾塞那肽的發現及成功上市，胰高血糖素樣肽-1可以有效抑制胃排空，使腸胃蠕動減少，可以幫助人們控制食物的攝入，達到減輕體重的目的，但是由于胰島血糖素樣肽-1的半衰期時間非常短，只有幾分鐘，人們通過不懈的努力，將其養殖為艾塞那肽，作為治療糖尿病的有效藥物成功上市。

2.2基于分子合成的多肽藥物

多肽藥物的合成目前來看仍是一項耗資較大、風險較高的工程，近年來，不同的理論合成方法及分子模擬技術在多肽藥物的合成中得到了較為廣泛的應用。由于多肽藥物合成過程的耗資較大，使用的成本原料較為昂貴，所以如何減少藥物合成中雜質的出現是目前比較熱門的研究。

3　肽合成中氨基酸消旋化的作用機制

消旋化的作用機制分為直接烯醇化和5(4H)-噁唑酮兩種。

3.1直接烯醇化

肽縮合過程中，受堿催化的烯醇化機制有著重要作用，消旋的程度與活化羥基α位質子的酸性、堿性、溫度及溶劑有關。氨基酸α位質子的酸性程度又與取代基的性質有關。

3.25(4H)-噁唑酮

5(4H)-噁唑酮是肽合成過程中的重要中間體，氨基酸活化的過程中會產生5(4H)-噁唑酮。5(4H)-噁唑酮的化學結構不穩定，是導致氨基酸消旋化的主要原因。噁唑酮對氨基酸的解速率與形成能力直接影響了肽耦合反應的消旋能力。另外，氨基組分的親核能力對多肽的縮合反應也有很大的影響[5]。

4　非對應異構體雜質的控制及相關問題

4.1加強原料的質控

各種保護氨基酸是合成多肽藥物的直接來源，因此，應加強對原料光學純度的質控，從根源處下手。目前大多數多肽藥物合成時，在初始原料保護氨基酸的內控標準中，僅將旋度作為主要標準。但是，因比旋度檢查受到專屬性及靈敏性的限制，使得此項指標不能作為控制氨基酸光學純度的考核指標，對于旋度數更小的保護氨基酸更是無法滿足。因此，加強對初始原料保護氨基酸光學純度的質量控制更為重要。

4.2嚴格規范工藝過程

在多肽的合成過程中，肽鍵與消旋之間是競爭關系，因此，應對消旋的機制熟悉掌握，對氨基酸側鏈保護基及縮合試劑重點關注，考察投料比與反應條件，盡可能將消化程度降至最低。另外，當目標肽中存在His、Cys以及Phe等氨基酸時，對合成工藝需要更為關注，此類氨基酸易發生消旋化，在進行此類氨基酸的縮合時，可考慮使用D-構型的氨基酸制作差向異構體的對照品。采用色譜條來檢查當前工藝條件下氨基酸的消旋化程度，進一步改善縮合工藝。根據相關研究表明[6]，使用高效的縮合試劑，增加保護氨基酸的投料量，可提高肽鍵縮合速度，降低消旋的程度及風險。

4.3選擇最佳的檢測方法

與大部分合成藥物的檢測方法相同，多肽藥物中非對映異構體雜質也可以通過HPLC進行檢測，常用的系統為反相色譜，使用C4、C8、C18等。相關研究表明，使用C18柱、水、乙腈進行梯度洗脫后的色譜系統對固相法合成的七肽可進行良好的分離。但是，當肽鏈增長以后，小部分氨基酸消旋化產生的非對應異構體雜質通過反相色譜無法檢測出，此時可綜合產品的性質使用其他的色譜系統，如毛細管電泳法、離子交換色譜法等。離子交換法在低到中壓環境下進行分離多肽產物的效果顯著。有研究證實，將NaAc作為起始緩沖液，將含有NaAc的NaCl溶液作為終止緩沖液，可在CM-52陽離子纖維素柱的水解膠原多肽中成功分離4個組分，證明例子交換法分離多肽產物的作用。

根據相關研究表明，多肽的光學純度可以采用HPLC-MS進行檢測。首先，多肽在DCl/CD3COOD溶液中進行水解，使用N-a(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺將水解后的氨基酸再次進行衍生化，使用普通的 RP-HPLC 或 GC 即可將衍生化后的 D 和 L-構型的氨基酸良好分離，可以將多肽中消旋氨基酸的含量進行測量。在這個過程中使用氘(D)代試劑水解是非常重要的，因為在水解的過程中，氘(D)是消旋氨基酸的α位質子，通過檢驗可區分多肽中原有的氨基酸與水解中產生的消旋、該方法的專屬性優良，適用范圍較廣，廣泛應于肽類藥物的檢測中。

4.4優化存儲及運輸條件

多肽藥物的穩定性較差，所以在常規的凍干、制劑及運輸過程中會受到溫度、濕度及pH的影響后發生水解或消旋。因此應綜合肽類藥物的特性及穩定優化實驗條件及運輸條件，進行穩定性測試，將得到多肽藥物的最佳環境進行記錄，根據環境優化凍干及制劑的條件。例如，某抗艾多肽在弱堿性環境中可保持較高的穩定性，那么凍干與制劑的過程中應盡量避免使用酸性及強堿性制劑，因為消旋化是不可逆的反應，所以即便后續步驟中可以通過試劑來調節酸堿值，但一旦在調和前發生消旋，影響藥物的純度和有效性。

5　結　語

消旋的產生會丟失肽分子整體或部分的化學信息，加之多肽類藥物的生物活性與其立體結構有直接關系，所以加強對多肽合成過程中非對應異構體雜質的研究有重要意義。氨基酸消旋化產生的非對映異構體雜質是多肽藥物合成過程中的重要環節，而大部分研發人員對此類雜質的研究與關注甚少，通過本次研究希望可以引起相關領域人員的重視，加強每個環節的質控，采用合適的方法對非對映異構體雜質研究檢測。

[1]黃惟德,陳常慶.多肽合成[M].北京:科學出版社,1985:47.

[2]MERRIFIELD R B. Solid phase peptide synthesisⅠ. The synthesis of atetrapeptide[J].J Am Chem Soc,1963,85:2149-2154.

[3]郜炎龍,吳超柱,徐凡,等.多肽藥物固相合成中的水解雜質和非對映異構體雜質的研究[J].重慶理工大學學報(自然科學版),2014,28(3):69-76.

[4]汪雪峰,董利陽,王鈞,等.治療自身免疫性疾病多肽藥物的研究進展[J].中國藥理學通報,2014,30(5):732-734,735.

[5]張宇,烏恩,王國成,等.肽合成[J].天津藥學,2011,23(5):54-58.

[6]付曉菲,徐風華,蘇歡歡,等.多肽藥物酰米菲肽抗抑郁作用研究[J].第二軍醫大學學報,2014,35(5):539-543.

Related Exploration of Diastereomer Impurities in the Synthesis of Peptide Drugs

PANJun-feng

(Shenzhen Hybio Pharmaceutical Co., Ltd., Guangdong Shenzhen 518054, China)

The diastereomer research and control of impurities in the synthesis of peptide drugs were investigated. Through research of the mechanism of action of racemic amino acids in synthesis of peptide drugs, observing the corresponding isomer impurity production process, reasonable quality advice was put forward from the aspects of synthesis of raw materials, process operation and test method. After understanding the partial hydrolysis amino acid hydrolysis to produce impurities and despun create the corresponding heterogeneous impurities is important material for the synthesis of peptide drugs, strengthening the diastereomer impurities and control was put forward.

diastereomer impurities; polypeptide drugs; racemic

潘俊鋒(1978-)，男，中級工程師，本科，從事藥物合成等工作。

O62

A

1001-9677(2016)012-0053-02