犬孕酮幾種檢測方法比較

賈佳麗，王　輝，韓　飛，李　樂，鄭小凡（.新鄉市動物衛生監督所，河南　新鄉　453000；.新鄉雅仕杰醫學檢驗所）

?

犬孕酮幾種檢測方法比較

賈佳麗1，王輝2，韓飛1，李樂1，鄭小凡1
（1.新鄉市動物衛生監督所，河南新鄉453000；2.新鄉雅仕杰醫學檢驗所）

犬是季節性發情動物，發情周期不同于其他動物，排卵時間在發情期間變化復雜，其最佳配種時間判定較困難。常規判定方法主要有滴血推定時間判定法、陰門觀察推定法、陰門腹側檢查法、試情法等。儀器檢測法主要有陰道鏡檢測法、陰道涂片檢測法、孕酮檢測法、唾液檢測法、測卵儀檢測法和超檢測法等。確定母犬排卵時間的范圍最可靠的方法是測定孕酮。孕酮的測定方法主要有電化學發光法、免疫熒光法、ELISA法、放射免疫法。本文針對犬孕酮的檢測方法進行綜述。

孕酮俗稱黃體酮，是由黃體和胎盤產生的一種甾體激素，是卵巢黃體成熟后分泌的一種天然孕激素，分子式：C21H30O2；分子量：314.47。在體內對子宮內膜形態學影響顯著，在胚囊著床的子宮內膜準備和維持妊娠方面發揮著至關重要的作用。而且孕酮還是介于內分泌和免疫系統交互作用的重要因子，具有調節月經周期，誘導子宮內膜增殖、分化，促進血管生成，激活淋巴細胞分泌非炎性細胞因子，如IL-3、IL-4、IL-10，維持妊娠環境的作用。

1　電化學發光法（ECL）

電化學發光的測試方法主要利用電化學三電極體系，通過對工作電極施加一定的電壓，使溶液中的電活性物質之間發生電子得失，在電極表面形成激發態并產生光輻射，利用光檢測器捕獲并經過計算機處理得到電化學發光信號。已報道的ECL物質包括三聯吡啶（［Ru（bpy）32+］）的釕、鋨和錸類絡合物、魯米諾、吖啶酯等。常用的抗體標記物有吖啶酯標記、三聯吡啶釕。

電化學發光法可以有效消除樣本的本地干擾和樣本對位量的散射，從而獲得更高的靈敏度，其檢測下限可達10-18～10-19mol/L，而且其試劑有效期長，檢測快速準確，安全無毒。

例如ADVIA Centaur CP孕酮測定試劑盒，在標記試劑中，病人樣品的孕酮結合到吖啶酯標記的小鼠單克隆抗孕酮抗體上。在固定試劑中游離的抗體與孕酮衍生物結合在一起，并通過共價鍵結合到順磁性顆粒上，通過檢測磁性顆粒對孕酮進行定量。

2　放射免疫法（RIA）

RIA是由Yalow和Berson于1959年創建的一種體外放射分析技術。原理是應用放射性同位素標記待測物，形成標記抗原。以一定量的標記抗原，與各種不同量的非標記待測物和一定濃度的特異性抗待測物抗體相互作用，其反應遵照質量作用定律，標記待測物與非標記待測物競爭抗待測物抗體的結合部位，產生不同的結合率。當標記的待測物與抗待測物抗體的量保持一定時，則標記的待測物與抗待測物抗體形成的復合物的多少就反映了待檢物的含量。按照結合率與非標記待測物量為函數，畫出標準競爭抑制曲線。根據測得的結合率，在曲線上找出相應的待測物量，得出精確的待檢標本的待測物含量。

放射免疫測定法因為操作較復雜，需時間較長，需有一定的設備，又有放射性污染，使其應用一度受到一定限制。當今放射免疫法已經變得非常簡單，購買試劑盒可以短時間快速解決所有問題。使用新型的碘125標記，輻射對人體的傷害也變得微乎其微。

放射免疫測定法是綜合應用放射性核素的靈敏性和免疫反應的特異性的一種超微量測定方法。具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、反應范圍廣等優點。目前已知可用本方法測定激素、多肽、蛋白質、維生素、藥物和其他生物活性物質300余種。

例如孕酮放射免疫分析藥盒，采用了第二抗體+聚己二醇沉淀放射法放射免疫分析實驗，含孕酮（PROG）的樣品和125I標記的孕酮衍生物與抗體反應形成抗原抗體符合物，反應加入二抗及PEG，使免疫復合物沉淀，離心，測沉淀放射性計數。通過標準曲線得到樣本中孕酮的濃度。

3　酶聯免疫吸附測定法（ELISA）

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann，荷蘭學者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法（ELISA）。

ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。例如兔抗孕酮試劑盒，就是孕酮與孕酮辣根過氧化酶（-HRP）酶聯試劑之間的競爭結合。在溫育時，羊抗兔IgG包被的微孔與孕酮標準品、對照品、患者樣品，孕酮-HRP酶聯試劑和兔抗孕酮溫育反應，HRP標記的孕酮結合的量與標準品、樣品或定性的對照血清中內源性孕酮對特異性孕酮抗體結合部位結合的量相競爭。這樣，結合到微孔上的酮-HRP的量進一步減少，因為樣品中的孕酮濃度在增加，然后棄去未結合的孕酮-HRP并洗滌微孔，加入顯色劑溫育顯色，再加入HCL終止反應并在450 nm處測量光密度值，孕酮-HRP的量與樣品中孕酮的量呈反比例關系并與所形成的顏色的深淺成一定比例，通過標準品濃度對吸收值標繪出標準曲線。孕酮ELISA試劑盒樣品與標準品一同操作的對照品孕酮的濃度可以從標準曲線上計算出來。

4　小結

孕酮在發情前期即將結束時開始升高，一般達到5 ng/mg時即可排卵。一般在母犬發情之后，進行陰道黏膜檢查，當陰道角質化到達50%，孕酮達到4～5 ng/ml時，發情母犬進入最佳配種期，一般在孕酮達到4～5 ng/ml后的1～3 d內完成配種。對孕酮進行監測，能更好地把握配種時間。

孕酮的檢測方法除了上述的3種外，還有報道用免疫熒光法測定孕酮含量，但臨床測定中已經很少使用。電化學發光法、ELISA法、放射免疫法三種方法比較，試劑方面，放射免疫法和酶聯免疫法都已經國內量產，化學發光法試劑及全自動化學發光免疫分析儀儀器以進口產品占主導。在測量精度上，酶標法是定性與半定量測量，化學發光法為定量測量。線性試驗和靈敏度檢測中，電化學發光法優于放射免疫法。對人體的的傷害，放射免疫法有一定的放射性，酶標法的底物有一定的致癌性，化學發光法比較安全。干擾因素方面，放射免疫法和酶標法干擾因素較多。電化學發光法有很強的優勢，在犬的孕酮檢測中可以靈活使用。一般可使用簡單儀器結合常規判定方法進行判斷，昂貴犬種可使用更加精密的儀器進行測定。

收稿日期：（2016-02-26）

中圖分類號：S829.2

文獻標識碼：

文章編號：1004-5090（2016）04-0042-02