家貓線粒體DNA的研究進(jìn)展

雷曉雨 中國刑事警察學(xué)院 110854

谷黨恩 廣東省廣州市公安局花都區(qū)分局刑警大隊(duì)技術(shù)中隊(duì) 510800

魏文宇 浙江省臺(tái)州市公安局黃巖分局 318000

寧　雪 中國刑事警察學(xué)院 110854

家貓線粒體DNA的研究進(jìn)展

雷曉雨 中國刑事警察學(xué)院 110854

谷黨恩 廣東省廣州市公安局花都區(qū)分局刑警大隊(duì)技術(shù)中隊(duì) 510800

魏文宇 浙江省臺(tái)州市公安局黃巖分局 318000

寧雪 中國刑事警察學(xué)院 110854

隨著生活水平的提高，越來越多的人開始在家里飼養(yǎng)寵物，尤以寵物狗為多。近些年有好多家庭開始養(yǎng)貓。關(guān)于寵物狗的研究已有很多，但是關(guān)于貓的研究卻很少。在我們?nèi)粘Ｉ钪校埵侨祟惖呐笥阎唬埮c我們的生活息息相關(guān)，近來與貓有關(guān)的糾紛及案件越來越多。家貓線粒體DNA（mtDNA）是細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，蘊(yùn)藏著大量的生物信息，本文將對(duì)家貓的mtDNA進(jìn)行闡述。

法醫(yī)物證學(xué)；線粒體DNA；家貓

1　家貓與法庭科學(xué)

一項(xiàng)來自于美國寵物產(chǎn)品制造協(xié)會(huì)的研究報(bào)道稱［1］，59.5％的美國人至少擁有一只寵物貓或者寵物狗。美國獸醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)報(bào)道，從2001年到2006年擁有寵物的家庭由61.1萬增加到68.7萬，增加了12.4％。關(guān)于成年寵物貓毛發(fā)增長的研究顯示，平均每年每千克生長32.7g，粗略看來，一個(gè)有15磅家貓（6.8kg）存在的家庭每年產(chǎn)毛量為223g，這也暗示了在一個(gè)養(yǎng)貓的家庭中有成千上萬的貓毛存在。一項(xiàng)模擬獸毛轉(zhuǎn)移的犯罪現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查得出結(jié)論，進(jìn)入一個(gè)養(yǎng)家畜的家庭幾乎不可能不被他們的毛發(fā)污染。倘若涉事當(dāng)事人一方或者雙方為寵物擁有者或者犯罪現(xiàn)場(chǎng)就在寵物居住地，在受害人或者犯罪嫌疑人之間轉(zhuǎn)移寵物毛發(fā)就有很大的可能性。

基于DNA測(cè)試的進(jìn)步，收集到的與犯罪現(xiàn)場(chǎng)有關(guān)系的動(dòng)物毛發(fā)的證據(jù)價(jià)值越來越重要［2］。現(xiàn)如今，通過一根頭發(fā)去識(shí)別一個(gè)個(gè)體是可行的，只需要提供一根有毛囊或者只剩下毛囊的檢材就可以有效地獲得細(xì)胞核DNA去進(jìn)行認(rèn)定。個(gè)體識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)是Short tandem repeat（STR）。研究表明，從50％帶毛囊的貓毛發(fā)中可以獲得STR基因分型。然而，除了毛發(fā)粗細(xì)不均之外，不是所有毛發(fā)都包含毛根，沒有毛囊就沒法產(chǎn)生細(xì)胞核DNA。法醫(yī)生活環(huán)境調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大約95％的毛發(fā)處于最后的生長階段，即毛發(fā)的靜止期，靜止期的毛發(fā)不包含毛囊。因此，在痕量證據(jù)中線粒體DNA含量豐富，可能對(duì)于遺傳分析來說是唯一可獲得的資源。

盡管沒有直接的研究統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)證明脫落的貓毛發(fā)依然有毛囊存在，眾所周知家貓對(duì)梳洗打扮要求又極其苛刻。脫落的貓毛發(fā)，沒有毛囊，也可能含有足夠的上皮細(xì)胞DNA可以用來作mini-STRs、mtDNA或者其他DNA遺傳標(biāo)記的檢驗(yàn)。例如，在有貓毛出現(xiàn)作為證據(jù)的情況下，當(dāng)STR分析失敗，貓毛線粒體DNA序列分析可以作為一種包含或者排除的工具，已經(jīng)成功在至少一個(gè)刑事犯罪現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查或者涉及殺人犯的案件中起到作用。在2003年美國愛荷華州本·奧唐納的案例中，通過對(duì)幾個(gè)家貓線粒體DNA的檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果被作為佐證給主要嫌疑犯定了二級(jí)謀殺罪［3］。

2　家貓線粒體DNA

家貓線粒體全基因組序列長17009bp，已被測(cè)序證實(shí)其序列符合哺乳類動(dòng)物線粒體DNA的主要特征。除NADH脫氫酶（ND2）起始密碼子ATC（non-AUG）基因外，密碼子使用和堿基組成也繼承了規(guī)范的脊椎動(dòng)物模式。家貓線粒體DNA控制區(qū)橫跨大約1560bp，包含兩個(gè)明顯的重復(fù)序列置于高度保守的核心序列的兩側(cè)。

脊椎動(dòng)物線粒體基因主要編碼氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)移的主要成分，許多無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞也有簡單的雙鏈環(huán)狀線粒體基因組。絕大多數(shù)哺乳類動(dòng)物，線粒體基因組包含13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因，雖然從后獸亞綱分離出來，但是保留了基本的基因組織形式。在非編碼的控制區(qū)有很多畸變，D-1oop管理轉(zhuǎn)錄，復(fù)制主要在線粒體DNA的編碼區(qū)。線粒體DNA的序列和長度偏差主要表現(xiàn)在控制區(qū)。

（1）貓的細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA組成部分。貓的線粒體DNA是由13個(gè)結(jié)構(gòu)性開放性閱讀框（ORFs）、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和1個(gè)控制區(qū)組成。家貓線粒體DNA序列包含幾個(gè)在其他哺乳類動(dòng)物均有的特征。第一，所有的開放性閱讀框的方向和其他同源的哺乳動(dòng)物的開放性閱讀框相同，沒有重新排列。第二，ND1、ND2、COIII，、ND3、ND4基因缺少完整的終止密碼子，然而，完整的終止密碼子可能讀到tRNA基因下游就直接終止了ND1和ND2。根據(jù)人類的模型冒昧地認(rèn)為貓的線粒體轉(zhuǎn)錄是聚腺苷酸化，絕大多數(shù)貓的線粒體終止密碼子是TAA。第三，無視開放性閱讀框終止密碼子下游的tRNA基因（比如ND1和ND2），在ATPase 8和ATPase 6、ND4、ND4L、ND5和ND6基因編碼序列部分重疊。第四，家貓輕鏈復(fù)制起始點(diǎn)（ORL）的d（C-G）比麻斑海豹少，麻斑海豹復(fù)制起始點(diǎn)d（C-G）含量豐富，占53％，但是家貓復(fù)制起始點(diǎn)（ORL）有一個(gè)穩(wěn)定的莖環(huán)（stem-1oop）結(jié)構(gòu)。2個(gè)rRNA基因及主要的結(jié)構(gòu)基因和其他相關(guān)哺乳類動(dòng)物線粒體DNA相比沒有明顯長度差異。

家貓線粒體DNA由32.5％A、26.2％C、14.2％ G和27.1％T組成。類似于麻斑海豹的線粒體DNA，家貓線粒體DNA在哺乳動(dòng)物間含有更高的dG，但是在家貓線粒體DNA結(jié)構(gòu)基因第三密碼子區(qū)域?qū)G有強(qiáng)烈的偏差。除了I1e和Phe密碼子外，家貓線粒體DNA密碼子選擇的模式和其他哺乳動(dòng)物線粒體DNA選擇偏好一樣。與麻斑海豹密碼子選擇相比，家貓線粒體DNA多了一個(gè)TTT，可能以損害TTC密碼子為代價(jià)。另外，家貓ND2啟動(dòng)基因不是AUG密碼子，而是ATC（I1e），這個(gè)結(jié)果也在老鼠和馬的ND3和ND5基因觀察到［4］。與其他哺乳動(dòng)物基因形成對(duì)照，ATPase 8基因在3，通過復(fù)制一個(gè)Q residue，形成的原因可能是在DNA復(fù)制過程中的滑移。最后，在線粒體DNA基因中共有34bp組成了未翻譯的間隔核苷酸。

（2）家貓tRNA基因分析。家貓線粒體DNA中tRNA和其他脊椎動(dòng)物一樣，是典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)分子，比如說反密碼子（AC）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、T-F-C臂和氨基酸臂（A-A），這些結(jié)構(gòu)在許多家貓線粒體tRNAs中可以觀察到。與牛和麻斑海豹tRNA序列相比較，絕大部分不同發(fā)生在T-F-C臂、二氫尿嘧啶核苷環(huán)或者位于AC莖環(huán)和T-F-C臂之間的被稱為“易變”環(huán)的區(qū)域。在His、G1n、Phe、Pro、Tyr、Leu和Asp tRNAs基因二氫尿嘧啶核苷環(huán)發(fā)生的插入和缺失突變與牛科動(dòng)物線粒體DNA基因不同。比如，家貓tRNA-Phe基因比牛科動(dòng)物長3bp。在所有動(dòng)物的比較中，tRNA的AC環(huán)區(qū)域比較保守。此外，家貓tRNA-Leu（CUN）基因比麻斑海豹長，這就更好地解釋了ND5 5，邊界不清，導(dǎo)致它的序列比其他哺乳動(dòng)物長3個(gè)殘基（M-K-V）。盡管有補(bǔ)償機(jī)制，但是與牛科動(dòng)物線粒體DNA相比，家貓A1a、Va1和Met tRNA序列在AC莖環(huán)包含大量的突變。

（3）家貓線粒體DNA控制區(qū)。家貓線粒體DNA橫跨大約1560 bp。家貓線粒體DNA控制區(qū)（CR）有一個(gè)與眾不同的特征，在控制區(qū)高度保守的核心序列兩邊分別有一個(gè)重復(fù)序列（RS2和RS3），他們一起使家貓線粒體控制區(qū)比人類多了447 bp。這樣的重復(fù)序列的位置使家貓和其他哺乳動(dòng)物相比控制區(qū)更為保守。RS3，位于家貓線粒體輕鏈3，端（開始于nt pos.270），長度為294bp，含有大量的d（C-A）重復(fù)［24］，同其他食肉動(dòng)物一樣，類似于核微衛(wèi)星［5］。RS3包含一個(gè)6-到8-bp核心單元，ACACACGT，不完全重復(fù)37次。RS2位于控制區(qū)輕鏈5，端，包含3個(gè)完整的80-到82-bp單體（a–c），他們之間互相高度保守，相似性為91％～98％。家貓RS2基因序列和它同源的蝙蝠和鼩鼱科有67％～74％的相似性。家貓?jiān)谒约旱?，RS2c序列顯示出最大的分歧，然而它5，在縮短后只有34bp，重復(fù)單位（pos.16504）和其他種類比有94％的相似性和一個(gè)缺失。家貓RS2包含幾個(gè)回文序列（5，TACAT-ATGTA 3，），該回文序列開始位置在pos.16507，可能來源于二級(jí)結(jié)構(gòu)，也可能是在D-1oop復(fù)制中起末端序列關(guān)聯(lián)（TAS）作用［5］。和一個(gè)重復(fù)單位相比，大批量的或者2到3個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的RS2重復(fù)會(huì)更穩(wěn)定。

3　家貓線粒體研究現(xiàn)狀

脫落的家貓毛發(fā)是一種極好的痕量證據(jù)，盡管它的分析價(jià)值既沒有鑒別也沒有全容量的開發(fā)出來。2011年Christy R.Tarditi等人為了法醫(yī)學(xué)應(yīng)用檢測(cè)家貓線粒體DNA控制區(qū)。選用美國四個(gè)州的174只家貓，對(duì)線粒體DNA控制區(qū)402bp進(jìn)行測(cè)序，選定的區(qū)域排除了兩端有問題的串聯(lián)重復(fù)序列。結(jié)果在所有選取的個(gè)體中都出現(xiàn)了4種常見的線粒體單倍型，異質(zhì)性為1.7％。在18只家貓中出現(xiàn)獨(dú)特的線粒體單倍型，占研究總體的10.3％。在個(gè)體識(shí)別方面顯示，每10只隨機(jī)選取的家貓有8.3只可以通過該區(qū)域測(cè)序達(dá)到排除。該區(qū)域的遺傳特征和產(chǎn)生的數(shù)據(jù)庫支持法醫(yī)學(xué)應(yīng)用［6］。

4　展望

隨著全世界對(duì)家貓研究的日益重視，很多國家在法庭科學(xué)上應(yīng)用了家貓作為證據(jù)，同時(shí)對(duì)于家貓線粒體DNA的深入研究也在進(jìn)行中。目前，家貓的地理分布較為廣泛，有良好的遺傳多態(tài)性，而家貓的mtDNA單倍型跟種屬之間的關(guān)系比較復(fù)雜，但隨著研究的深入，更多的mtDNA單倍型被發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)樹進(jìn)一步細(xì)化。同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，通過對(duì)相關(guān)生物檢材mtDNA等遺傳物質(zhì)的檢測(cè)，推測(cè)犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留下的生物檢測(cè)的相關(guān)信息，可為偵查提供方向。

［1］American Pet Product Manufacturing Association（APPMA）. National pet owner's survey.Greenwich，CT：APPMA，2006.［2］Higuchi R，von Beroldingen CH，Sensabaugh GF，Erlich HA. DNA typing from single hairs.Nature 1988；332（6164）：543-6.

［3］Halverson JL，Lyons LA.Forensic DNA identification of feline hairs：casework and a mitochondrial database.Proc Am Acad Forensic Sci 2004；X：B150.

［4］Arnason，U.，Gullberg，A.，Johnsson，E.，andLedje，C.（1993）.The nucleotide sequence of the mitochondrial DNA molecule of the grey seal，Halichoerus grypus，and comparison with mitochondrial sequences of other true seals.J.Mol.Evol. 37：323–330.

［5］Hoelzel，A.R.，Lopez，J.V.，Dover，G.A.，and O'Brien，S.J.（1994）.Rapid evolution of a heteroplasmic repetitive sequenceinthemitochondrialDNAcontrolregionofcarnivores.J.Mol.Evol.39：191–199.

［6］Christy R.Tarditi，B.S.；Robert A.Grahn，Ph.D.；Jeffrey J. Evans，B.S.；Jennifer D.Kurushima，B.S.；and Leslie A.Lyons，Ph. D.MitochondrialDNASequencingofCatHair：An Informative Forensic Tool.J Forensic Sci，January 2011，Vol. 56，No.S1 doi：10.1111/j.1556-4029.2010.01592.x.