NPPB基因多態性與海南黎族原發性高血壓相關性研究

范美竹，云美玲，周代鋒，李天發，黃珊，李繼科，歐陽鵬飛

(1.貴陽中醫學院研究生院，貴州 貴陽 550002；2.海南醫學院附屬醫院心內科，海南 海口 570102；3.海南醫學院生物化學教研室，海南 海口 571101)

·論 著·

NPPB基因多態性與海南黎族原發性高血壓相關性研究

范美竹1，云美玲2，周代鋒3，李天發2，黃珊2，李繼科2，歐陽鵬飛1

(1.貴陽中醫學院研究生院，貴州 貴陽 550002；2.海南醫學院附屬醫院心內科，海南 海口 570102；3.海南醫學院生物化學教研室，海南 海口 571101)

目的 探討腦鈉肽基因(NPPB)的RS3753581突變位點與海南黎族人原發性高血壓發病的相關性。方法采用特異性等位基因PCR方法對海南626例黎族高血壓病患者(觀察組)及616例黎族健康人(對照組)的NPPB基因RS3753581突變位點進行多態性檢測。采用SPSS16.0統計學軟件分析兩組基因型頻率以及等位基因頻率。結果觀察組突變位點RS3753581的CC、CA、AA基因型的頻率分布分別為89.7%(562/626)、7.5%(47/626)、2.8%(17/626)，對照組分別為98.0%(604/616)、1.0%(6/616)、1.0%(6/616)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=7.206，P=0.027＜0.05)。觀察組C、A等位基因頻率分別為93.5%(1 170/1 252)、6.5%(82/1 252)，對照組分別為98.5%(1 214/1 232)、1.5%(18/1 232)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=6.885，P=0.009＜0.05)。結論腦鈉肽基因突變位點RS3753581多態性與海南黎族人高血壓病具有相關性。

黎族；原發性高血壓病；基因多態性；相關性

原發性高血壓(Primary hypertension)是高血壓的一類，其占高血壓的比例大于95%。眾多研究認為高血壓病是遺傳和環境因素共同引起的與多種基因表達相關的遺傳性疾病，其發病具有顯著家族聚集性[1]，其遺傳機制是一種微效基因作用模式，即主要通過性狀數量遺傳模式的劑量-效應關系，達到發病閾值，再聯合環境因素作用，之后導致原發性高血壓發病。由于分子生物學、生物信息技術學發展迅速，從基因的角度研究原發性高血壓發病機制是醫學研究熱點[2]。

海南地處中國的熱帶區域，黎族人群是海南原住居民，由于自然地理位置的隔斷和黎族比較封閉保守的婚戀原則，導致黎族基因與漢族基因之間的遷移較少，一定程度上造成了黎族基因的保守性，從而使黎族基因具有其獨特性。再者，原發性高血壓也是黎族除地中海貧血之外的聚集性疾病之一。本文旨在研究海南黎族原發性高血壓與腦鈉肽基因(Brain natriuretic peptide，BNP)[3]RS3753581位點多態性的相關性，從基因水平上探討遺傳因素在原發性高血壓發病中的地位和作用[4]，以期為對高血壓人群的篩選，及早識別原發性高血壓高危人群提供新的有力理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年6月至2015年6月從海南省陵水黎族自治縣人民醫院隨機選取海南籍黎族高血壓患者626例作為觀察組，所有患者的高血壓病診斷均符合2010年《中國高血壓防治指南》[5]中的診斷標準；選取同時期海南籍黎族健康居民616例作為對照組。提取所有研究對象靜脈血6 mL，按SDS法提取DNA。

1.2 特異等位基因PCR擴增

1.2.1 引物設計與合成 從Ensemble datebase中獲得NPPB基因序列，采用Primer5.0破解版軟件進行引物設計，并由上海生物工程有限公司進行合成，見表1。

表1 特異性等位基因PCR的引物序列及擴增片段長度

1.2.2 PCR反應條件 80 μL反應體系中DNA模板(10ng/μL)8μL，上下游引物各4μL，1×TaqPCRMast。

1.2.3 PCR擴增PCR反應條件 Mix 40 μL，ddH2O24 μL，94℃預變性3.5 min；94℃變性35 s；60℃退火35 s；72℃延伸35 s，34個循環；72℃延伸3.5 min。之后委托上海生物工程有限公司進行序列測定。利用Chroma軟件讀取測序圖。

1.3 統計學方法 對基因型頻率、等位基因頻率數據應用SPSS16.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組受檢者一般資料比較 兩組受檢者的體質量指數(BMI)、血壓、甘油三酯(TG)、心率等比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 分型結果 黎族高血壓患者基因組PCR擴增電泳圖見圖1。

圖1 RS3753581突變位點基因分型PCR擴增電泳圖

表2 兩組受檢者一般資料比較(±s)

表2 兩組受檢者一般資料比較(±s)

注：1 mmHg=0.133 kPa。

組別觀察組對照組t值P值例數626 616 BMI(kg/m2) 23.25±2.05 24.31±2.08 28.056 0.590 SBP(mmHg) 151.85±29.62 112.13±19.44 14.212 0.001 DBP(mmHg) 86.66±16.48 74.76±10.52 62.394 0.000 TG(mmol/L) 3.81±1.25 1.33±0.87 4.212 0.003心率(次/min) 82.4±18.13 82.10±18.4 64.054 0.000

2.3 測序結果 觀察組的測序結果驗證見圖2～圖4，對照組的測序結果驗證見圖5～圖7。

2.4 兩組受檢者的NPPB基因RS3753581多態位點比較 觀察組中可檢測出CC、CA、AA三種基因型，頻率分布分別為89.7%(562/626)、7.5%(47/626)、2.8%(17/626)；對照組可檢測出CC、CA、AA三種基因型，頻率分布分別為98.0%(604/616)、1.0%(6/616)、1.0%(6/616)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=7.206，P=0.027＜0.05)。觀察組C、A等位基因頻率分布分別為93.5%(1 170/1 252)、6.5%(82/1 252)，對照組C、A等位基因頻率分布分別為98.5%(1 214/1 232)、1.5% (18/1 232)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=6.885，P= 0.009＜0.05)。

圖2 RS3753581突變位點(210)基因分型樣本的測序：CC基因型，測序的陰性圖譜

圖3 RS3753581突變位點(206)基因分型樣本的測：CA基因型，測序的陽性圖譜

圖4 RS3753581突變位點(231)基因分型樣本的測序：AA基因型，測序的陽性圖譜

圖5 RS3753581突變位點(228)基因分型樣本的測序：CC基因型，測序的陰性圖譜

圖6 RS3753581突變位點(201)基因分型樣本的測序：AA基因型測序的陽性圖譜

圖7 RS3753581突變位點(206)基因分型樣本的測序：CA基因型，測序的陽性圖譜

3 討 論

原發性高血壓是以體循環動脈壓升高為主要表現的心血管綜合征。高血壓病對心腦腎周圍動脈等靶器官均造成損害，如在所有高血壓患者中，有20%～30%可查到左室肥厚，輕度高血壓患者發生左心室肥厚機率比正常血壓增多2～3倍，而重度高血壓可達10倍[6-7]。高血壓是冠心病的主要危險因素之一，高血壓病患者患冠心病的危險是正常者的2倍，長期高血壓不治療，有50%死于冠心病。腎臟參與高血壓的形成與維持，反過來，腎臟又因血壓升高而損害，長期高血壓沒有治療，可引起終末期腎功能衰竭，或加速腎實質的破壞導致原發或繼發的腎臟疾病。

NPPB在心室和心房均可表達，主要表達在心室，腦鈉肽受基因轉錄表達水平調控。因此，NPPB基因多態性可能對BNP的轉錄、合成及分泌產生作用。有研究表明基因位點的幾種常見變異與血循環中的利鈉肽濃度緊密相關，引發不同個體間血壓的差異以及高血壓。

本實驗結果顯示，兩組患者CC、CA、AA基因型的頻率分布比較差異有統計學意義(χ2=7.206，P=0.027＜0.05)，說明該位點突變與否與黎族人高血壓病密切相關；而C、A等位基因頻率分布比較差異也有統計學意義(χ2=6.885，P=0.009＜0.05)，說明該位點多態性與海南黎族人群原發性高血壓發病風險具有相關性。

由于本實驗采用的是等位基因特異性PCR方法，且研究對象數量有限，NPPB基因RS3753581多態性位點是否與原發性高血壓的發病有明顯相關性，是否可作為我國黎族人群原發性高血壓發生的遺傳學標志，還有待于大樣本病例對照實驗加以驗證。同時還需進一步對NPPB基因上的RS3753581位點進行功能性研究，更加深入探討RS3753581位點多態性參與原發性高血壓發生發展的可能生物學機理。

[1]Hauser ER,Mooser V,Crossman DC,et al.Design of the genetics of early onset cardiovascular disease(GENECARD)study[J].Am Heart J,2003,145(4):602-613.

[2]Newton-Cheh C,Larson MG,Vasan RS,et al.Association of ommonvariants in NPPA and NPPB with circulating natriuretic peptides and blood pressure[J].Nat Genet,2009,41(3):348-353.

[3]黨連生,徐燕,劉美玲,等.BNP水平與原發性高血壓嚴重程度相關性研究[J].現代預防醫學,2012,39(6):1558-1561.

[4]Lahiri DK,Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,1993,31(7-8): 321-328.

[5]中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南[J].中華心血管病雜志,2011,39(7):579-616.

[6]Tsutamoto T,Wada A,Maeda K,et al.Attenuation of compensation of endogenous cardiac natriuretic peptide system in chronic heart failure:prognostic role of plasma brain natriuretic peptide concentration in patients with chronic symptomatic left ventricular dysfunction [J].Circulation,1997,96(2):509-516.

[7]Gruchala M,Ciecwierz D,Wasag B,et al.Association of the Sca I atrial natriuretic peptide gene polymorphism with nonfatal myocardial infarction and extent of coronary artery disease[J].Am Heart J, 2003,145(1):125-131.

Study on the relationships between NPPB gene polymorphisms and primary hypertension of Li Nationality in Hainan.

FAN Mei-zhu1,YUN Mei-ling2,ZHOU Dai-feng3,LI Tian-fa2,HUANG Shan2,LI Ji-ke2,Ouyang Peng-fei1. 1.Graduate School of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,Guizhou,CHINA;2.Department of Cardiovascular,Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA;3.Department of Pathology,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between brain natriuretic peptide gene(NPPB) RS3753581 and primary hypertension of Li Nationality in Hainan.MethodsA total of 626 patients with hypertension (observation group)and 616 healthy people(control group)were detected for NPPB gene polymorphisms by allele-specific polymerase chain reaction(PCR).Genotype frequency and allele frequency of the two groups were analyzed by SPSS16.0 statistical software.ResultsThe CC,CA,AA genotype frequency distribution of RS3753581 were 89.7% (562/626),7.5%(47/626),2.8%(17/626)respectively in the observation group,and 98.0%(604/616),1.0%(6/616), 1.0%(6/616)respectively in the control group,with statistically significant difference between two groups(χ2=7.206，P= 0.027＜0.05).The allele frequency of C,A were 93.5%(1170/1252),6.5%(82/1252)in the observation group,and 98.5%(1214/1232),1.5%(18/1232)in the control group,with significant difference between two groups(χ2=6.885,P= 0.009＜0.05).ConclusionNPPB gene RS3753581 polymorphisms are associated with primary hypertension of Li Nationality in Hainan.

Li Nationality;Primary hypertension;Gene polymorphism;Relationship

R544.1

A

1003—6350（2016）12—1893—03

2016-03-14)

海南省自然科學基金項目(編號：80586)；海南省教育廳重點科研資助項目(編號：HjKj2008-43)；海南省海口市重點科技計劃項目(編號：2013-53)

云美玲。E-mail：yunmeiling518@163.com