2型糖尿病患者腸道菌群特異性生物標志物研究進展*

曾藝鵬，胡凌紅 綜述，馮新格 審校

(上海市浦東醫院：1.中醫科；2.檢驗科　201399)

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·綜述·

2型糖尿病患者腸道菌群特異性生物標志物研究進展*

曾藝鵬1，胡凌紅2綜述，馮新格1審校

(上海市浦東醫院：1.中醫科；2.檢驗科201399)

2型糖尿病；腸道菌群；生物標志物

2型糖尿病(T2DM)是一種受遺傳和環境雙重影響的綜合性疾病，而后者被認為是導致發病率增加的主要原因。近年來已有報道腸道菌群與肥胖存在關聯[1]，同時有諸多研究報道胰島素抵抗也是一種低級的炎性反應[2]，而胃腸道菌群兼具基因及環境雙重因素。假設腸道菌群對宿主的肥胖表型、代謝及炎性狀況具有預測性意義，腸道菌群的分布、基因及代謝產物等可以作為研究人體代謝性疾病的生物性標志物。

1　人體腸道菌群的組成

人腸道中至少存在1 014個微生物，這些微生物基因有數百個人類不具備的基因[3]。這樣一個復雜的腸道微生物群，主要由細菌組成，其中大部分不能培養。腸道菌群能增加能量吸收和儲存，增加酵解和吸收不消化的糖類[4]。同時腸道菌群參與免疫反應維持腸道免疫系統的動態平衡，如它們在腸道對T細胞亞群分化和B細胞分化成IgA分泌細胞起重要作用[5-6]。腸道菌群主要由3個門的細菌組成，分別是革蘭陽性的厚壁菌門和放線菌門，以及革蘭陰性的擬桿菌門。目前主要通過16S rRNA技術進行腸道菌群多樣性的分析，厚壁菌是最大的菌門，而放線菌門雖然也是一個主要的菌門，但是通過RNA測序通常被遺漏，只能通過熒光原位雜交檢測[7]。新生兒腸道菌群的建立起初是通過母親的產道或皮膚，腸道菌群一開始是定植的兼性需氧菌，隨后是厭氧菌。腸道菌群在組成上會保持一種相對的穩定，直至老年，但是只有在許多變量保持不變的情況下才能保持暫時的穩定。如飲食改變能明顯影響腸道菌群，在動物實驗中，老鼠從高脂肪、高糖飲食轉向低脂肪、富含植物多聚糖飲食，在24 h后就能改變腸道微生物菌群結構。一些研究甚至發現，環境與腸道菌群分布更密切，有時甚至超過基因遺傳。如，異卵雙胞胎和同卵雙胞胎的腸道菌群分布都相似[4]，不同小鼠共同生活后腸道菌群結構趨于相似[8]。抗生素的使用是改變腸道菌群的另一個環境因素。一些研究顯示采用抗菌藥物治療后，導致腸道菌群大的改變。腸道抗細菌定植作用下降，使得一些外來菌生長，可能導致腸道菌群結構的長期性改變，這種改變可能導致疾病。盡管這些改變的菌種存在個體差異，其中一些不能在治療后的數月內恢復，事實上大多數個體存在菌種多樣性的下降。動物試驗發現，研究組小鼠經低劑量的抗菌藥物治療后，會導致代謝活動增加，消化復雜的糖類攝取更多卡路里[9]。這種方式也增加了代謝活動的產物——短鏈脂肪酸的產量，同時伴隨增加了向肝臟門靜脈循環的輸出量，促進了脂肪合成。

2　腸道菌群與肥胖、胰島素抵抗及T2DM的關系研究

生活方式的改變和高能量食物的攝取，無疑是世界范圍內肥胖病流行的重要因素之一。同時，腸道內菌群通過從食物中攝取能量對新陳代謝活動也會產生影響。而后者被認為是導致肥胖及肥胖并發癥(如胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病)的重要外界環境因素。腸道微生物移植入這些無菌小鼠體內后，可以起到調節其骨質密度、促進脂肪的囤積、促進腸血管生成及促進免疫應答發育的作用[10]。通過宏基因組學和無菌動物模型等技術方法為研究腸道菌群在能量代謝中的作用及其與代謝性疾病之間的聯系奠定基礎。

肥胖患者腸道內的菌群組成會發生改變，并且可能隨著體質量的變化而變化。在人類肥胖病患者的糞便排泄物中，相比對照，厚壁菌門細菌相對較多，而擬桿菌門細菌相對較少。通過限制脂肪或糖類的攝入，體質量減少伴隨擬桿菌水平相應提高[1]。在胃旁路手術后體質量降低的肥胖患者身上也出現了類似的情況，這些患者體內擬桿菌和普氏菌的數量與能量和脂肪的攝入量呈負相關[11]。但也有研究并未發現類似現象，甚至有相反的結論，原因可能是因為使用了不同的臨床標準(如肥胖的程度、年齡、減肥的強度和熱量限制持續的時間)、地理位置、人口規模和微生物分析方法。盡管肥胖和能量攝取可以影響微生物菌群的組成比例，但是否會影響人類肥胖病的機制還不甚清楚。

胰島素是維持血糖動態穩定的主要激素，通過胰島素受體的自磷酸化激活其生物學效應。細胞因子和趨化因子分泌可能削弱胰島素信號通路，在T2DM患者中T細胞分泌更高的IL-17和IFN-γ，導致一種炎癥前狀態；其他一些細胞因子如TNF-α和IL-6，都與胰島素抵抗相關。同時，體內固有免疫也能影響胰島素抵抗，Toll樣受體起著重要作用。細菌脂多糖能激活Toll樣受體4，上調炎性表達水平，然后誘導胰島素抵抗。如果Toll樣受體4基因變異或被敲除，則可能防止胰島素抵抗[12]。高脂肪飲食可能會增加革蘭陰性菌/革蘭陽性菌的比值，致血液脂多糖增加引起內毒素血癥和代謝性疾病[13]。動物試驗中，對高脂肪飲食老鼠使用抗菌藥物能降低血液脂多糖濃度，能緩解糖尿病和肥胖癥的指征[14]。

最近有研究報道腸道菌群在T2DM的發展進程中可能起著重要作用[15]，全基因組相關研究(GWAS)為我們進一步認識這一作用打開了一扇窗。研究人員對T2DM患者的腸道菌群進行分析，發現糖膜運輸、支鏈氨基酸運輸、甲烷代謝、外源性化合物降解及硫酸鹽還原等作用增強；同時，他們也發現丁酸合成、細菌耐藥性、鞭毛組裝及維生素和輔酶代謝等作用下降[15]。該研究也發現T2DM患者的腸道環境刺激細菌產生對氧應急反應和藥物的抵抗。

3　T2DM生物性標志物的篩選與評估

3.1厚壁菌/擬桿菌比值分析腸道微生物群的組成在肥胖人群中有變化，而且它能應對體質量變化。有報道肥胖患者相比對照組，有著特殊的腸道菌群：少的擬桿菌，多的厚壁菌[1,4,7]。擬桿菌隨著體質量的下降而增加，暗示擬桿菌可能會影響熱量的攝入[1]。另一研究發現胃旁路術導致體質量減輕，對于肥胖人更是降低糖尿病及心血管疾病的風險[11]， 在這些患者中擬桿菌和普雷沃菌水平升高與能量攝入和肥胖呈負相關[11]。 但是也有一些研究不認為厚壁菌與擬桿菌的比例有轉換，也有報道指出擬桿菌下降，并非厚壁菌上升，而是放線菌上升[4]。動物實驗中，Toll樣受體2敲除老鼠表現出厚壁菌相對性升高和稍微高的擬桿菌。但是，它們12周后體質量增加，20周后變胖，提示腸道菌群的改變可以導致肥胖[16]。

Crohn 病研究發現患者在腸道菌群的整體多樣性有明顯下降，微生物的組成有明顯變化[1,10]，T2DM的厚壁菌門比例和梭菌屬比例有明顯下降[11]。擬桿菌門被認為富含磷酸轉移酶系統，參與糖類處理；厚壁菌門富含運輸系統。其中有75%與肥胖相關的基因來自放線菌，25%來自厚壁菌；而42%與瘦相關基因來自擬桿菌。功能性分析提示它們中的許多參與糖類、脂質和氨基酸代謝[4,16]。這些發現提示一個核心腸道菌群基因組的存在，影響代謝功能的改變，而不是簡單的細菌群多樣性或相對豐度的變化[4]。

3.2腸道菌群腸型分析單純的去研究腸道微生物的不同組分而言，最近提出的腸型(Enterotypes)的研究似乎更有意義。2011年，《Nature》發表了一篇對腸道微生物分型研究的文章，研究者把腸道微生物群落分成了3個腸型[17]，該研究結果被《Science》雜志評為2011年十大科學突破之一。研究人員通過主成分分析根據腸道菌群中的主導微生物，將3個腸型分別稱其為腸型1(Enterotype 1)——擬桿菌型、腸型2(Enterotype 2)——普雷沃菌型和腸型3(Enterotype 3)——瘤胃球菌型。瘤胃球菌通常較難分離，部分會歸入擬桿菌型[18]。腸型的分類與人的年齡、體質量、性別或國籍不相關，每一個腸型在如何處理能源、產生哪一種維生素、可能影響人類宿主健康的因素等方面有所不同。同時另一個研究小組發現，腸型似乎與飲食相關[18]。例如，肉類飲食使類桿菌屬細菌迅速繁殖；而素食則促進普雷沃屬細菌迅速繁殖。這兩種腸型都不受10 d內飲食限制的影響，表明他們受更長期的飲食趨勢的影響。

由154名美國人[4]和85名丹麥人[19]組成的較大樣本的腸道微生物組研究也適合分成這3種腸型，這表明在人體腸道內，菌群平衡的腸道菌類型的數量有限。然而有一篇報道不認為T2DM與腸型存在必然聯系[20]，因此對腸型與疾病的關聯性還需要更多的工作去研究。

3.3細菌基因豐度的分析通過對肥胖和非肥胖人員腸道細菌基因豐度的分析發現，研究組和對照組有不同的基因數量，即豐度[21]，且這些人群中呈現明顯的雙峰分布。這些基因包括已知和未知菌種的基因，相比高細菌基因豐度的人群，一些具有低基因豐度的人群顯示出更突出的肥胖、胰島素抵抗、糖代謝紊亂等表型。Le等[21]對于大量腸道微生物基因(主要是細菌的基因豐度)在不肥胖和肥胖的個體丹麥人之間的差異進行了描述。作者發現，可以通過以很小一部分細菌種屬的基因豐度為基礎從而得出整體上細菌基因豐度。其次，低細菌基因豐度的個體要比高細菌基因豐度的個體整體上具有更高水平的脂肪(即肥胖)，并伴有與炎癥相關的一些特性。他們還發現，在肥胖志愿者中，那些低細菌基因豐度的個體要比高基因豐度的個體更容易發胖，說明他們具有與炎癥相關的腸道微生物群。

Cotillard等[22]證實在腸道低細菌基因豐度的肥胖和超重的人群中通過能量限制的飲食會產生微生物豐度的增高和炎癥減少的結果，但這種飲食干預的方法對于那些高基因豐度的人群則不起作用。這一結果說明細菌種類基因豐度在特殊人群中存在差異性分布的特點，同時對于個體對飲食干預的回應能力具有預測性。這一概念的產生使臨床研究及藥物研發大有可為，因為它為個體患者的藥物訂制和微生物生態的重新制定開啟了新的途徑。

3.4宏基因組基因關聯群組(MLG)及宏基因簇(MGCs)使用類似GWAS的方法發現都有哪些DNA組出現了問題，再使用所謂的宏基因組關聯研究(MGWAS)確定T2DM患者和非T2DM患者體內宏基因組之間的差異。通過這種MGWAS技術他們一共發現了4.2萬多個與T2DM有關的基因標志物，這可是一個天文數字，這么多信息在一時之間很難被徹底地消化和處理。所以為了簡化問題，消除不必要的冗余信息，研究者又設計了宏基因組基因關聯群組(MLG)[23]或是宏基因簇(MGCs)[24]的方法。

根據基因標志物的相對豐度或者分類將T2DM患者和非T2DM患者體內的宏基因組模式加以歸納和提煉，這樣就解決了當前在宏基因組分析工作中出現的兩個最主要的問題。第一個問題就是到目前為止，我們在進行宏基因組分析工作中采用的分析方法一直都是將測序結果與現有的微生物參考序列進行比對，再根據比對結果推測被測微生物組的微生物組成種類及其功能。但是有很多時候我們得到的測序結果在參考數據庫中根本就找不到與之匹配的參考微生物，比如被測的微生物是非常少見的微生物等，所以這些信息也就無法采用，也就不能真正確定被測微生物組到底由哪些微生物組成。不過有了MLG和MGCs方法之后，這些罕見的基因也都可以被納入規模更大的MLG[23]或MGCs[24]當中，再也不會被漏掉了。第二個問題就是單純采用分類法也會出現失誤，因為基因在微生物之間是可以流動的，而且微生物自身的基因也是會發生變異的，所以簡單采用分類的方法進行分析經常會得到錯誤的結果。

3.5特異性菌群研究發現如果人體內缺少了一種產丁酸鹽細菌就容易患上T2DM[23]。丁酸鹽是一種可以被腸道細胞使用的能量分子，它也有助于減弱結腸炎性反應。所以如果因為缺失產丁酸鹽細菌使得腸道內的丁酸鹽含量降低，就會增加腸道內的炎性反應，導致胰島素抵抗進而患上T2DM。Qin等[23]還發現在T2DM患者的結腸內有機會致病菌增多以及微生物基因組中耐氧化壓力基因增多的現象，這些情況也都有助于增加腸道內的炎性反應。

胃旁路術可能具備直接的抗糖尿病作用[25]，具體機制不明，除前面提到的這些人糞便中的微生物群組成發生了改變，提示胃旁路術后腸道菌群改善了患者的代謝表型。特別是一種有益的細菌——柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)在肥胖和糖尿病中低豐度，而在術后增加了。普拉梭菌是一種與炎性負相關的生物性標志物，它可能參與調節肥胖和糖尿病中的系統性炎癥，而且能改善糖尿病。

攝食菊粉能增加柔嫩梭菌和雙歧桿菌水平。同樣在飲食誘導肥胖老鼠中，相比同樣高脂肪飲食老鼠而未投益生素，益生素能選擇性的增加雙歧桿菌屬，這種增加同時伴肥胖減輕、微生物源炎性分子水平(如脂多糖)降低[19]。人如果增加食用抗性淀粉，會增加糞便中布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii) 和直腸真桿菌(Eubacterium rectale)水平，它們與纖維素酵解相關[26]。消化抗性淀粉有助于提高胰島素敏感性[27]，但是不同個體間微生物應對抗性淀粉有差異，因此需要個性化方案[26]。

肥胖更容易從食物中攝取能量，伴隨氫元素的轉移，與肥胖相關的產氫普氏菌和利用氫氣產甲烷古生菌同時增加[28]。動物實驗中，如果多行擬桿菌定植老鼠，同時定植史氏甲烷短桿菌會增加食物果聚糖酵解增加。多行擬桿菌制造更多的乙酸和甲酸鹽，而史氏甲烷短桿菌利用甲酸鹽生成甲烷。這種合作增加了糖類酵解，從腸道吸收更多的能量，相比單獨定植多形擬桿菌老鼠更容易導致肥胖[29]。

對這些與臨床相關的特異性細菌進行研究，有助于將工作化繁為簡，可以應用常規的一些PCR方法對這些細菌進行擴增或定量擴增。通過薈萃分析，我們擬對T2DM患者腸道特異性細菌進行單獨或聯合檢測，驗證其在臨床的應用效果。

4　小　結

盡管這些生物性標志物分類的方法需要進一步明確，但我們已經很清楚在腸道微生物與人類生理狀態之間存在著臨床相關的關聯性。就像目前研究比較多的腸道菌群與肥胖之間的關聯性，微生物的組成以及細菌性基因豐度等指標可以將健康的胖子與患有代謝性疾病的胖子區分開，以及其干預后的反應。將腸道微生物劃分成特異性生物標志物將是一個很吸引人的方法，通過集合性的微生物種群組、基因組或菌株等作為一種生物標志物來預測T2DM。

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2015-12-28修回日期：2016-05-17)

上海市浦東新區區科委項目(PKJ2012-Y20)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.035

A

1673-4130(2016)15-2142-04