一種新型結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的研究

黃國(guó)清，蔡長(zhǎng)爭(zhēng)，何樹(shù)泉，胡波，鄔艷波，蔡芬蘭，舒少為

(1.深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518110；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510630)

一種新型結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的研究

黃國(guó)清1，蔡長(zhǎng)爭(zhēng)1，何樹(shù)泉1，胡波2，鄔艷波1，蔡芬蘭1，舒少為1

(1.深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518110；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510630)

目的 探討利用熒光量子點(diǎn)(QDs)開(kāi)發(fā)新一代結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)方法。方法采用特異性多克隆抗體偶聯(lián)到磁珠上用于結(jié)核桿菌的分離和富集，然后用標(biāo)記QDs的鏈霉親和素檢測(cè)結(jié)合生物素標(biāo)記的肝素血凝素(HBHA)單克隆抗體的結(jié)核桿菌。采用牛結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌作為陽(yáng)性樣品，以大腸桿菌和沙門氏菌作為陰性對(duì)照，以評(píng)估該方法的可行性。結(jié)果用抗酸染色能檢測(cè)到磁珠分離和富集的結(jié)核桿菌，直接觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照有熒光，但陽(yáng)性對(duì)照可以觀察到熒光。直接觀察法的檢測(cè)限為104細(xì)菌/mL。當(dāng)采用熒光光度計(jì)檢測(cè)樣品時(shí)，其檢測(cè)限可以達(dá)到103細(xì)菌/mL。結(jié)論該方法能適用于包括結(jié)核分枝桿菌病原體的檢測(cè)，是一種具有前景的病原體的檢測(cè)方法。

熒光量子點(diǎn)；結(jié)核分枝桿菌；檢測(cè)

結(jié)核病是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，自1985年以來(lái)結(jié)核病疫情在全球范圍內(nèi)急劇上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，目前全球有近1/3的人，即20億人口感染了結(jié)核桿菌，其中活動(dòng)性肺結(jié)核患者約2 000萬(wàn)，每年新增結(jié)核患者800～1 000萬(wàn)，每年約有300萬(wàn)人死于結(jié)核病[1-3]。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核患者數(shù)居世界第二位[4]。近年來(lái)由于免疫缺陷性疾病，如人免疫缺陷性病毒(HIV)的感染、腫瘤患者和營(yíng)養(yǎng)不良者的增多，以及多藥耐受的結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，結(jié)核患者的人數(shù)呈上升趨勢(shì)。結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)對(duì)于結(jié)核患者的早期診斷、治療進(jìn)程的監(jiān)控以及流行病學(xué)調(diào)查有著重要的意義。目前常規(guī)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，一般采用痰涂片檢測(cè)、金標(biāo)準(zhǔn)的固體和液體培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗(yàn)和分子診斷等方法，但均因存在靈敏度和特異性較低，費(fèi)時(shí)或價(jià)錢昂貴等缺陷，難以完全滿足臨床實(shí)際的需要，為及時(shí)而準(zhǔn)確地對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行診斷和治療，開(kāi)發(fā)新型的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒已成為亟待解決的問(wèn)題。隨著納米生物材料和納米技術(shù)的發(fā)展，功能化的磁珠可以用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌的分離和富集，熒光量子點(diǎn)由于具有較有機(jī)熒光素優(yōu)越的許多獨(dú)特的光學(xué)特性，如其發(fā)射峰波長(zhǎng)可由組成材料和粒徑大小來(lái)調(diào)節(jié),其激發(fā)光波長(zhǎng)范圍很寬,具有較大的斯托克位移和狹窄對(duì)稱的熒光譜峰，從而具備了一元激發(fā)、多元發(fā)射的特點(diǎn),且穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于有機(jī)染料，適合于體內(nèi)和體外對(duì)病原體和其他目標(biāo)分子的檢測(cè)。

在本研究中，我們用磁珠表面耦聯(lián)抗結(jié)核分枝桿菌屬特異性抗體用于結(jié)核分枝桿菌的分離和富集，然后用生物素化的抗-HBHA單抗，再用結(jié)合鏈霉親和素的的熒光量子點(diǎn)(QDs)進(jìn)行檢測(cè)，用牛結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌作為陽(yáng)性樣品和以大腸桿菌和沙門氏菌為陰性對(duì)照對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)并研究其檢測(cè)限。

1 材料與方法

1.1 抗體 本研究中所用的抗體包括抗結(jié)核分枝桿菌肝素-結(jié)合血凝素(Heparin-binding hemagglutinin，HBHA)單克隆抗體(Santa Cruz公司)。生物素標(biāo)記的抗結(jié)核分枝桿菌PPD的兔多克隆抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)，生物素標(biāo)記的抗羊抗小鼠的多克隆抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.2 抗結(jié)核菌抗體與免疫磁珠(MBs)的結(jié)合 用上面提到的生物素標(biāo)記的多克隆抗體功能化結(jié)合鏈霉親和素包被的MBs。為了這個(gè)目的，40 mg抗體加到200 mL(10 mg/mL)的MBs，在室溫下孵育30 min。除去沒(méi)有結(jié)合的抗體，在磁場(chǎng)的作用下用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5次結(jié)合的MBs(Dynal MPC-s,Invitrogen，CA，USA)，溶解在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中。

1.3 鏈霉親和素的QDs的功能化 CeSe QDs (15～20 nm)，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為655 nm，用ZnS為其外殼，和含一個(gè)羧基的多聚體(Q21321MP，Invitrogen，USA)。在按照說(shuō)明書操作前，用鏈霉親和素包被。簡(jiǎn)單地說(shuō)，50 ml的QDs稀釋到400 mL的硼酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)中，96 mL的鏈霉親和素溶液(10 mg/mL，Invitrogen，CA，USA)和11.4 mL的EDC (10 mg/mL，Sigma-Aldrich，MO，USA)，室溫下孵育90 min。鏈霉親和素包被的QDs用500 ml的硼酸緩沖液(50 mmol/L，pH 8.3)洗5次，然后溶解到50 mmol/L硼酸鹽(pH 8.3)緩沖液，至終體積為500 mL。

1.4 細(xì)菌菌株 為了評(píng)估，我們用牛結(jié)核桿菌(Pasteur)和結(jié)核分枝桿菌(n=3)作為陽(yáng)性對(duì)照，這些菌株生長(zhǎng)在Middlebrook 7H11(BD，USA)(含有OADC (油酸、白蛋白、葡萄糖和過(guò)氧化氫酶)、0.4%丙酮酸(Sigma-Aldrich，Germany)。陰性對(duì)照為大腸桿菌(E. coli，n=2)和沙門氏菌(Salmonella，n=4)，這些陰性對(duì)照細(xì)菌在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid，UK)上培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測(cè)限 為了評(píng)估每種方法的檢測(cè)限(Limit of detection，LOD)，我們用2份牛結(jié)核桿菌BCG溶液。系列稀釋后，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌學(xué)技術(shù)確定其范圍為108～10細(xì)菌/mL。簡(jiǎn)單描述如下，幾個(gè)長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的克隆懸浮在含PBS和6個(gè)玻璃珠的無(wú)菌旋蓋瓶中。為了使大塊的細(xì)菌團(tuán)分散，懸液用漩渦器混合幾秒鐘，然后放置5 min。懸液中細(xì)菌的數(shù)量用濁度計(jì)比色確定。LOD定義為能與陰性對(duì)照差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最低濃度。

1.6 細(xì)菌檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)的原理是基于用屬特異的多克隆和小鼠單克隆生物素化的抗體耦聯(lián)MBs分離細(xì)菌，最終用鏈霉親和素結(jié)合的QDs檢測(cè)熒光信號(hào)(圖1)。為了這個(gè)目的，1 mL每個(gè)稀釋度的細(xì)菌，組成為陽(yáng)性和陰性對(duì)照或等體積的PBS-BSA(0.1%)空白，首先用結(jié)合MBs的屬特異多克隆抗體40 μL，然后加入1 μg(每個(gè)500 ng)HBHA單克隆抗體，然后1 μL(0.2 mg/mL)抗小鼠的生物素化的抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)，最后加入鏈霉親和素包被的QDs 4 μL。對(duì)于每個(gè)雜交步驟，稀釋液在37℃輕微震蕩20 min，在磁場(chǎng)作用下分離，用PBS-BSA(0.1%)。為了直接觀察熒光，樣品在UV燈(312 nm)下觀察，熒光強(qiáng)度也可以用熒光光度計(jì)(Infinite M200，Tecan USA)檢測(cè)。

圖1 細(xì)菌的檢測(cè)原理

2 結(jié) 果

2.1 抗結(jié)核桿菌抗體和MBs的結(jié)合 抗體和納米粒結(jié)合前后用分光光度計(jì)在280 nm檢測(cè)抗體是否和MBs的表面結(jié)合。進(jìn)一步證實(shí)有抗體結(jié)合或無(wú)抗體結(jié)合后分離結(jié)核桿菌后采用抗酸染色是否MBs和抗體有結(jié)合(圖2)。與抗體結(jié)合的結(jié)核桿菌通過(guò)磁珠分離后染色陽(yáng)性，但沒(méi)有結(jié)合抗體的結(jié)核桿菌通過(guò)磁珠分離沒(méi)有得到結(jié)核桿菌，因此，染色結(jié)果為陰性。

2.2 結(jié)核桿菌的檢測(cè)/檢測(cè)限 圖3表明空白和陰性對(duì)照沒(méi)有觀察到熒光信號(hào)，而結(jié)核分枝桿菌可以在檢測(cè)限之上觀察到陽(yáng)性。在本研究中，LOD被定義為104細(xì)菌/mL，即實(shí)驗(yàn)管能觀察到熒光。當(dāng)樣品用熒光檢測(cè)儀時(shí)本方法的檢測(cè)限能進(jìn)一步減少到103細(xì)菌/mL (圖4)。為了證明該方法的有效性，對(duì)樣品(陰性和經(jīng)過(guò)系列稀釋的陽(yáng)性對(duì)照)進(jìn)行涂片后熒光顯微鏡檢測(cè)。與結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性和陰性對(duì)照比較，磁珠周圍有熒光光暈。

圖2 結(jié)合多克隆抗體的磁珠結(jié)合富集結(jié)核分枝桿菌后的抗酸染色(×100)

圖3 直接熒光燈下觀察熒光

圖4 熒光光度計(jì)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)限

3 討 論

基于CdSe QDs可以檢測(cè)不同病原的DNA，該方法不易產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果，因?yàn)椴恍枰狣NA擴(kuò)增[5-7]。QDs同樣可以用于檢測(cè)結(jié)核桿菌的表面抗原。這種方法在方法學(xué)上比較簡(jiǎn)單，它不需要樣品處理，這點(diǎn)不同于需要DNA分離純化后檢測(cè)細(xì)菌DNA，因此，該方法適合床邊檢測(cè)。此外，使用QDs避免了在免疫檢測(cè)中使用熒光燃料的缺點(diǎn)，例如快速的光淬滅，較窄的激發(fā)廣譜和較低的信號(hào)強(qiáng)度。

筆者發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌通過(guò)抗體偶聯(lián)的MBs分離后，鏈霉親和素結(jié)合的CdSe QDs能夠特異地結(jié)合在結(jié)核桿菌病原體。該過(guò)程操作簡(jiǎn)便，不需要任何昂貴的設(shè)備。采用一個(gè)簡(jiǎn)單的光譜儀允許檢測(cè)1 000細(xì)菌/mL的樣品。下一步需要研究用其他蛋白或多個(gè)蛋白靶點(diǎn)或更明亮的QDs以提高其檢測(cè)限。本研究進(jìn)一步完善后用于臨床標(biāo)本的研究，并與現(xiàn)有的結(jié)核桿菌的檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比。

本研究使用結(jié)核桿菌HBHA抗原，其分子量為28 kD，是一個(gè)甲基化表面相關(guān)蛋白，能夠介導(dǎo)結(jié)核桿菌和宿主之間的相互作用。HBHA作為一個(gè)非吞噬細(xì)胞的粘附因子在結(jié)核分枝桿菌肺外播散起重要作用[8-9]。HBHA是一個(gè)具有重要意義的免疫反應(yīng)蛋白和結(jié)合的臨床指示物[10-11]，因此筆者選擇HBHA作為檢測(cè)靶標(biāo)。在本研究中，筆者同時(shí)采用了結(jié)核桿菌的多克隆抗體和單克隆抗體，能夠增加檢測(cè)的特異性，同時(shí)也方便對(duì)其他表達(dá)HNHA的病原體的檢測(cè)。此外，在研究中使用QDs標(biāo)記的鏈酶親合素，能適合檢測(cè)結(jié)合生物素的樣品。

總之，按照本研究的思路，采用不同類型的納米探針，不需要昂貴的設(shè)備，只需要磁性設(shè)備和一個(gè)熒光燈，可以檢測(cè)不同病原體DNA和其表面抗原。

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A novel detection method for Mycobacterium tuberculosis.

HUANG Guo-qing1,CAI Chang-zheng1,HE Shu-quan1, HU Bo2,WU Yan-bo1,CAI Fen-lan1,SHU Shao-wei1.1.Department of Laboratory Medicine,Shenzhen Longhua New District Central Hospaital,Shenzhen 518110,Guangdong,CHIAN;2.Department of Laboratory Medicine,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,Guangdong,CHINA

Objective To develop an assay incorporating cadmium selenide quantum dots(QDs)for the detection of mycobacterial surface antigens.MethodsThe bacterial cells were separated using magnetic beads coupled with genus-specific polyclonal antibodies and monoclonal antibodies for heparin-binding hemagglutinin.These complexes were then detected with anti-mouse biotinylated antibody and finally streptavidin-conjugated QDs which leads to the detection of a fluorescent signal.To evaluate the feasibility of the method,Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis(positive controls),as well as E.coli and Salmonella spp.that constituted the negative controls were applied.ResultsMycobacterium cells could directly be detected using acid-fast staining method after Mycobacterium cells were separated using immunomagnetic beads.The direct observation of negative samples did not reveal fluorescence as opposed to the mycobacteria mentioned above.The minimum detection limit of the assay was defined to 104bacteria/mL, which could be further decreased up to 103bacteria/mL when fluorescence was measured with a spectrofluorometer.ConclusionThe method described here can be easily applied for the pathogens including Mycobacterium tuberculosis, implying that this method has potential application for various different pathogens.

Quantum dots(QDs);Mycobacterium tuberculosis;Detection

R378.91+1

A

1003—6350（2016）07—1048—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.006

2015-11-22)

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013B090500101)；廣東省深圳市龍華新區(qū)科技創(chuàng)新資金“社會(huì)公益科研項(xiàng)目”(編號(hào)：2013092)

胡波。E-mail：hxb1993@sina.com