抗體親和力試驗的研究進展

藍翊文 秦 月

(1 中華人民共和國憑祥出入境檢驗檢疫局，憑祥市 532600，E-mail：735292951@qq.com；2 廣西壯族自治區疾病預防控制中心，南寧市 530028)

綜 述

抗體親和力試驗的研究進展

藍翊文1秦 月2

(1 中華人民共和國憑祥出入境檢驗檢疫局，憑祥市 532600，E-mail：735292951@qq.com；2 廣西壯族自治區疾病預防控制中心，南寧市 530028)

近年來，不少學者應用快速、準確、敏感的抗體親和力試驗鑒別病原體的原發感染和既往感染，解決相關疾病由于免疫等原因出現不典型癥狀的難題，為臨床制定預防和治療措施提供科學依據。抗體親和力檢測技術的日益成熟，為疾病檢測開啟了新篇章。本文對近年來該技術的實驗研究及應用作一綜述。

抗體親和力；抗原；感染；免疫；綜述

抗體親和力是指抗體分子的抗原結合位點與對應的抗原表位之間存在的引力，是抗原抗體之間固有的結合力，代表了兩者之間特異結合的緊密程度。抗體隨著機體初次接觸抗原時間的推移而逐漸成熟，初期抗體與抗原結合力較弱，即為低親和力抗體，隨著抗體的成熟，其親和力增加；當加入能降低抗原抗體結合力的物質(如尿素)時，低親和力抗體被洗脫，而高親和力抗體基本不受影響[1]。借此原理能建立檢測抗體親和力的方法，根據其的強弱可以大致判斷病原體感染的時間，確定是初次感染，即原發感染，或者是既往感染(包括繼發感染)。

抗體親和力因具有快速、準確、敏感的特點而備受學者關注。近年來，不少學者應用抗體親和力試驗鑒別病原體的原發感染和既往感染，解決相關疾病由于免疫等原因出現不典型癥狀的難題，為制定預防和治療措施提供科學依據。不僅如此，根據其鑒別原發/繼發感染的特點，抗體親和力試驗還可準確預測宮內感染的發生，以便臨床及時采取處置措施，降低新生兒出生缺陷的發生率[2-4]。抗體親和力檢測技術的日益成熟，為疾病檢測開啟了新篇章。本文對近年來該技術的實驗研究及應用作一綜述。

1 抗體親和力試驗的原理與檢測方法

1.1 基本原理 抗體親和力試驗前身是1989年Hedman等[5]為產前診斷風疹病毒而建立的尿素變性試驗。其基本原理是人體初次接觸抗原后，隨著時間推移B細胞不斷成熟，逐漸生成高親和力抗體；在尿素變性處理下，免疫初期產生的低親和力抗體會從抗原抗體復合物中解離出來，而后期產生的高親和力抗體仍與抗原牢固結合。通過低親和力及高親和力抗體的構成比可有效判別初次感染和既往感染。

1.2 常規檢測方法 以Hedman等[5]發明的測定風疹病毒抗體親和力的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法最具代表性：(1)在包被好風疹病毒抗原的酶標板中加入8 mol/L的尿素溶液；(2)血清樣本經磷酸鹽緩沖液(phophate buffer solution，PBS)-Tween緩沖液1 ∶100稀釋后加入酶標板中，每份血清平行加兩孔，37℃反應2 h后，一孔用PBS-Tween緩沖液洗滌3次，另一孔用加有8 mol/L尿素的PBS-Tween溶液洗滌3次，均每次浸泡5 min；(3)加入抗RV-IgG的堿性磷酸酶，37℃反應1 h，未被洗脫的抗RV-IgG則能與之結合，后用PBS-Tween洗滌3次，每次浸泡5 min；(4)加入顯色劑后用NaOH 終止反應，用酶標儀測定各孔的吸光度值(OD值)。計算親和力指數(avidity index，AI)，AI=經尿素處理的樣本OD值/相應未經尿素處理的樣本OD值×100%。1.3 AI的臨床意義 AI值大小反映出特異性抗體的親和力高低，應用到臨床上可判斷獲得性感染時間的長短。目前針對抗體親和力檢測研究的文獻大多采用Hedman等[5]報告的判定標準：AI<30%為低親和力抗體，表示原發感染；30%～50%為中等親和力抗體，表示可能與病原體既往原發感染有關；AI>50%為高親和力抗體，表示既往感染。這一標準也同樣被應用到其他病原體的檢測上，如Tuokko等[6]對麻疹病毒的檢測，其也是以AI<30%判定為低親和力抗體，AI>50%判定為高親和力抗體。

2 抗體親和力試驗技術的發展

2.1 變性劑的使用 尿素是親和力試驗中最常用的變性劑，早期研究發現6 mol/L和8 mol/L尿素均能有效鑒別近期感染和既往感染[7]。而Condorelli等[8]對6 mol/L和8 mol/L尿素的洗脫效果比較發現，使用6 mol/L尿素時，風疹患者在出疹后第3天和第46天的AI由16%上升至51%；而使用8 mol/L尿素時，親和力由13%變為36%，親和力上升緩慢，說明6 mol/L尿素能在感染后更早的檢測出低親和力抗體。此后的實驗較多以6 mol/L尿素代替8 mol/L尿素。

其他變性劑如異硫氰酸胍、檸檬酸、硫氰酸銨、二乙胺和鹽酸胍等在抗體親和力試驗中亦有使用。異硫氰酸胍腐蝕性強，對儀器損害大；檸檬酸(pH=3.0)解離效率好，腐蝕性小，對儀器損害小，相對較安全[9]。有學者將變性劑硫氰酸銨、二乙胺、鹽酸胍與尿素進行比較研究發現[10]：8 mol/L尿素組敏感性為 63.6%(7/11)，特異性為95.0%(19/20)； 35 mmol/L二乙胺組敏感性為72.2%(8/11)，特異性為95.0%(19/20)；4 mol/L鹽酸胍組敏感性為63.6%(7/11)，特異性為80.0%(16/20)；3 mol/L硫氰酸銨組敏感性為9.0%(1/11)，特異性為100%(20/20)。此實驗結果顯示：35 mmol/L二乙胺較8 mol/L尿素效果好，其余兩種變性劑效果不佳，但由于二乙胺極度易燃，具腐蝕性、強刺激性，可致人體灼傷，故實際使用效果沒有尿素好。2.2 血清稀釋度的選擇 在弓形體AI試驗中，Bonyadi等[11]按商品化試劑盒要求，對待檢樣本做初始稀釋后，繼續按1/3、1/6、1/9和1/18倍數稀釋血清，各稀釋血清分尿素處理組和未處理組，再進行余下的ELISA反應和測定計算AI值。結果發現當樣本中的特異性IgG抗體初始濃度大時，其相應的最佳稀釋度也越高；提示樣本中抗體起始濃度的高低直接影響到其AI值的大小，選擇最佳的樣本稀釋度可避免高濃度IgG抗體樣本可能導致的假陰性結果。

Jenum等[12]弓形體AI檢測試驗中也遇到此問題，于是將血清標本分別做兩個系列稀釋，一組做1 ∶50、1 ∶200和1 ∶800稀釋，然后用6 mol/L尿素洗脫來測定其ELISA的OD值；另一組做1 ∶200、1 ∶800和1 ∶3 200稀釋，但用試劑盒所配洗液洗脫測其OD值。最后將這兩組OD值帶入專門編制的終點滴度法公式，來計算其AI值。此方法解決了待檢樣本中抗體總量不同導致親和力測定結果不同的問題。

2.3 AI臨界值的設定 雖然Hedman等[5]對風疹病毒抗體AI臨界值設定的思路同樣適用于其他病原體感染分析，但不同的待檢病原體、不同的實驗條件及不同的試驗方法，都會有各自特定的AI臨界值。Revello等[13]以近期感染(<90 d)和過去感染(≥90 d)及反復感染人群為對象，研究巨細胞病毒感染的AI臨界值設定標準。按試劑盒要求以AI臨界值<20%判定為低親和力時，其判斷近期感染的靈敏度為92.8%；而若將AI臨界值改為<30%，則靈敏度變為100%，而且檢測的特異度不變。可見AI臨界值隨試驗不同而改變，應根據不同的試驗條件摸索出對應的臨界值標準。

2.4 其他檢測技術的發展 除了傳統尿素變性法外，限制性抗原親和力酶聯法(limiting antigen avidity enzyme immunoassay，Lag-Avidity EIA)和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)亦有應用。Lag-Avidity EIA法[14]原理為：抗原濃度較高時，高親和力和低親和力抗體的均有機會與抗原結合；當抗原濃度低時，抗原首先選擇與高親和力抗體結合，而低親和力的抗體與抗原結合不穩定，甚至不能與抗原結合。但是包被極低濃度的抗原難度較大，且檢測結果不穩定。經試驗，Lag-Avidity EIA法找到的最佳包被抗原濃度為0.063 μg/ml，在此濃度下，低親和力抗體與抗原結合不牢固，且在加入pH為3.0的檸檬酸后，能進一步阻止低親和力抗體與抗原結合，而高親和力抗體不受影響。據此區分低親和力和高親和力抗體，來判斷原發感染和既往感染。有學者[15]對比傳統尿素法和Lag-Avidity EIA法檢測艾滋病抗體陽轉者血清的親和力變化情況，發現這兩種檢測方法有較好一致性；但AI法要求平行雙孔，而Lag-Avidity EIA法只需單孔檢測，操作相對簡單。IFA法用熒光標記的抗IgG抗體代替酶標記的抗IgG抗體，與待測血清中的IgG抗體結合反應后，在熒光顯微鏡下觀察結果[16]。由于熒光色澤與背景色澤對比鮮明，含低親和力IgG抗體的血清用尿素處理后，可觀察到熒光強度明顯下降。實驗相關性和一致性分析表明，低親和力IgG抗體水平與IgM抗體水平顯著相關(P<0.05)，且一致性較好。但結果易受非特異熒光的干擾，需設計較多的試驗對照。

3 抗體親和力試驗的應用

3.1 鑒別原發感染 目前有較多種類的傳染病原發感染檢測應用了抗體親和力試驗，如風疹病毒[5]、巨細胞病毒[1-2，4]、弓形體[3]、艾滋病病毒[17]、單純皰疹病毒[18]等的檢測。在以往的實驗室檢測中，IgM陽性為判斷新近感染和活動期感染的指標。但在一些病原體被清除后，IgM抗體可能于較長時間以低濃度狀態存在；而另一些病原體在急性感染后，IgM抗體較早消失。因此，IgM抗體檢測存在出現假陽性或假陰性結果的可能。而且在繼發感染時也可能出現IgM抗體，故單靠IgM抗體判斷病原體的原發感染有一定的局限性[19]。另外，采集急性期和恢復期雙份血清，恢復期IgG抗體滴度在急性期的4倍以上亦可判斷是否為新近感染。但患者難于接受雙份血清的采集，且間隔較長時間的采樣也較難實施[20]。相關分子生物學技術如PCR法亦可作為原發感染的輔助檢測手段，但其檢測的時效性受限于病原被機體清除前，且病原體如被長期攜帶則無法鑒別。

隨著抗體親和力試驗技術的不斷成熟，其被認為是判斷原發感染較為可靠的診斷方法。有研究表明[21]：在巨細胞病毒IgM陽性患者中只有14%～18%能檢出低親和力IgG，在判斷是否為巨細胞病毒近期感染時，抗體親和力試驗的特異性明顯高于單純IgM抗體檢測。有學者研究認為懷孕6～18周的巨細胞病毒IgG親和力試驗診斷原發感染敏感度為100%，而IgM的診斷敏感度只有69%[22]。因此，抗體親和力試驗不僅可鑒別初次感染和二次感染，還可排除初次感染后幾個月或幾年殘存有IgM抗體的可能。

3.2 優生優育 抗體親和力檢測技術在診斷宮內感染及優生優育方面應用最廣。風疹病毒、人巨細胞病毒和弓形體這類病原體在人類多呈無癥狀感染或亞臨床癥狀，孕婦感染此類病毒后，特別是早期原發感染，易通過胎盤傳給胎兒，造成新生兒先天畸形，視力聽力障礙和智力障礙等嚴重癥狀。前瞻性研究發現[23]：我國人巨細胞病毒陽性母親所生小孩至周歲時人巨細胞病毒感染率達85.1%，懷孕早期感染人巨細胞病毒的嬰兒約15%～20%將終生殘疾[24]。因此對此類病毒原發感染的臨床評估極其重要。李牧等[25]對中晚期孕婦行弓形體IgG抗體親和力檢測，并對胎兒或新生兒臍血進行弓形體IgM檢測，發現原發性宮內感染率(53.45%)明顯高于繼發性宮內感染率(22.73%)；活動性宮內感染率(45.00%)高于非活動性宮內感染率(11.43%)。在孕婦巨細胞病毒感染研究中[26]，低親和力抗體者在不良孕產史孕婦中所占比例高于初次妊娠孕婦，提示不良孕產史孕婦的胎兒感染巨細胞病毒風險率高于初次妊娠孕婦組。抗體親和力試驗可高效診斷相關病原體宮內感染，有利于產前診斷和優生優育，且具有較高的臨床價值。

3.3 免疫狀態分析 盡管人群普遍接種風疹、麻疹和腮腺炎等疫苗，其相關的傳染病發病率得到了有效控制，但仍有少數病例發生。當疑似病例出現時，我們不僅需要確認是否由相關病原體引起，還要知道是否經免疫接種，或者免疫接種未成功，或免疫接種成功過但免疫力消失。抗體親和力技術已被用于免疫接種效果評價和免疫狀態區分。Souza等[27]在麻疹免疫效果研究中發現，初次免疫后2～8周抗體以低親和力形式存在，且隨著時間增長，親和力增加；在90份已接種兩劑疫苗的血標本和42份兒童臍血標本中未檢出低親和力抗體，證明抗體親和力技術是評價免疫效果較好的工具。Pannuti等[28]以107名無麻疹疫苗免疫史和52名有麻疹疫苗免疫史的患者為研究對象，發現97.2%無免疫史的患者呈麻疹抗體低親和力結果，即初次免疫反應；48.1%有免疫史患者未檢出IgG抗體或檢出低親和力抗體，即為免疫未成功的原發免疫失敗，51.9%有免疫史患者檢出高親和力抗體，即為免疫力消失的繼發免疫失敗。抗體親和力試驗可鑒別受種者的疫苗免疫狀態，特別是對那些計劃免疫工作薄弱地區或免疫史不明的人群的監測有較大意義。應用抗體親和力可指示免疫保護力下降的特點，可判斷人群是否需要再接種以及何時再接種。

4 商品化試劑盒的應用

在優生優育檢測中，已有抗體親和力檢測的商品化試劑盒。有學者[29]對意大利索靈公司和美國羅氏公司的巨細胞病毒親和力檢測試劑盒進行評估發現：二者的相對靈敏度為90.90%，相對特異度為98.25%，相對符合率為98.02%，兩種試劑盒的檢測效果滿意，臨床上應用前景較好。目前，仍有許多學者及機構在研制抗體親和力的檢測試劑盒。

抗體親和力試驗是判斷傳染病原發感染和非原發感染的最好方法之一，是對傳統病原學及免疫學檢測技術的重要補充。近年來，對該實驗技術的不斷摸索及持續改進，使得其靈敏度和特異度均有所提高，方法更易于應用。筆者相信今后會有越來越多的病原體抗體親和力檢測試劑盒推向市場。

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藍翊文(1969～)，女，研究生，主管技師，研究方向：病原微生物檢測。

R 446.6

A

0253-4304(2016)12-1744-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.32

2016-07-30

2016-10-18)