膠質瘤細胞中巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的表達研究

李艷娜1 馬靈筠2

1河南省周口市西華縣人民醫院 466000；2河南科技大學 河南洛陽 471003

膠質瘤細胞中巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的表達研究

李艷娜1 馬靈筠2（通訊作者）

1河南省周口市西華縣人民醫院 466000；2河南科技大學 河南洛陽 471003

目的研究巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的膠質瘤細胞中的表達。方法購買A172，U87，U251，LN229，GaMG，pA及pB，進行細胞培養、細胞免疫組化、Western blot分析、RT-PCR和real-time PCR。結果Β微管蛋白Ⅲ型（classⅢ β-tubulin）、微管相關蛋白2（MAP-2）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）均表達于2種膠質母細胞瘤組織、5種人膠質母細胞瘤細胞系中，均在各種腫瘤細胞中均一表達，但是神經絲蛋白70不表達于這些腫瘤細胞中。NSE在胞質核細胞核區域存在，但是和胞質相比，細胞核區域具有顯著較高的染色輕度。classⅢ β-tubulin、NSE均在各種細胞系中均一表達，但是MAP-2亞型在不同的細胞系或腫瘤組織中具有不同的含量，高分子量MAP-2在pA、U251、LN229中高表達，低分子量MAP-2在pB、A172、U87、GaMG中高表達，同時將兩種不同分子量的MAP-2表達出來。結論巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的膠質瘤細胞中的表達均隨著周圍環境的變化而變化。

巢蛋白；神經膠質酸性蛋白；神經元特異性烯醇化酶；膠質瘤細胞；表達

本文研究通過研究巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的膠質瘤細胞的表達情況及其在不同環境中的調控作用，并探討其表達量與膠質瘤患者預后的關系，利于后期膠質瘤的診斷及治療，具有重要實踐意義，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

購買美國ATCC公司生產的A172，U87，U251，LN229，采用諾美卑爾根大學提供的GaMG，從挪威霍蘭山大學醫院神經外科病人膠質瘤標本中提取pA及pB。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

設定標準細胞培養環境，進行細胞傳代，凍存細胞，進行細胞復蘇及細胞計數。

1.2.2 細胞免疫組化

1）細胞標本制作。將一層放置在37℃的溫度下2h的50μ g/ml聚左旋賴氨酸涂在12mm蓋玻片上，然后將適量細胞種植出來，2-3d細胞爬片。用PBS對標本進行2次清洗，用4%多聚甲醛進行10min的固定。用0.5%Triton X-100對標本進行4min的透化處理。用PBS對標本進行3次清洗，將PBS加入其中后在4℃的冰箱中放置將其保存起來；2）免疫染色。室溫下在封閉液中對細胞標本進行15min的放置，37℃下將細胞標本和一抗進行45min的孵育或4℃將細胞標本和一抗孵育過夜。用PBS對標本進行3次清洗，每次5min。37℃下將標本和二抗工作液進行45min的孵育。用PBS對標本進行3次清洗，每次5min，然后用三蒸水對其進行1次清洗。在每個標本中加入5μlVectashield固定液，其中含DAPI，常溫下避光保存，時長為2h，將蓋玻片邊緣封閉住，在此過程中將指甲油充分利用起來。檢查結果并將其保存下來，在此過程中將尼康Eclipse TE2000-E熒光顯微鏡充分利用起來。

1.2.3 Western blot分析

制備蛋白樣品，測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE凝膠電泳，在1.5ml的離心管中將18μl樣本準備出來，70℃下對混合樣本進行10min的加熱。組裝玻璃板和12孔NuPage 4-12%Bis-Tris膠，將500μl抗氧化劑及1倍NuPage MOPS SDS電泳緩沖液加入到電泳槽中，將1倍電泳緩沖液加入到外面空間中。將膠底部的氣泡排出，在上樣孔中加入15μl處理好的樣品及7μl SeeBlue Plus2 Prestained標準。插上電極， 200V下進行5min電泳。電泳過程中應該對電壓及電泳時間進行適當調節，在此過程中嚴格依據分子量。將膠從玻璃板上取下時應該從下端開始對凝膠進行剝離，使較自然脫落。然后轉膜，最后分析化學發光及結果。

1.2.4 RT-PCR和real-time PCR

提取細胞系總RNA，進行RNA定量，然后進行RT-PCT，最后進行實時定量PCR。

1.3 統計學分析

對結果進行分析，分析過程中將LCS480軟件充分利用起來，向Excel中導入，運用CT（2-△△CT）方法對數據進行分析。常規統計及t檢驗數據時采用軟件SPSS19.0，檢驗水準α=0.05。

2 討論

膠質瘤源自神經上皮細胞的腫瘤總稱，約占顱腦腫瘤的45%[1]，屬于臨床中較為常見的顱內惡性腫瘤。臨床學者提出了多種關于膠質瘤的起源及發展的假說，其中普遍認可腫瘤干細胞模型及克隆演變模型[2]。長期以來，膠質瘤認為起源于腦間質中的膠質細胞，且有部分學者通過研究表明：膠質瘤中表達神經元標記物，少數膠質瘤細胞中含有神經元特異性的離子通道。膠質瘤形成過程中極易使得神經元的不完全分化，或者來源膠質細胞腫瘤的惡心演變中，處于分化。惡性顱腦腫瘤往往包含較顯著的細胞異質性，膠質瘤細胞中含有其他多種類型的標記物，如：神經元標記物。因此，研究巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的膠質瘤細胞的表達研究具有重要意義。本研究結果表明，巢蛋白、神經膠質酸性蛋白和神經元特異性烯醇化酶的膠質瘤細胞中的表達均隨著周圍環境的變化而變化，值得臨床充分重視。

[1]張晉,金貴善,米蕊芳等.神經膠質瘤干細胞向內皮細胞分化的差異基因表達譜的分析[J].中華神經外科雜志,2015,31(3):299-303.

[2]陸娜,馮曉源,邸悅等.CT灌注成像評價人腦膠質瘤腫瘤血管生成[J].中國醫學計算機成像雜志,2014,20(6):481-484.

R329

A

1672-5018（2016）10-127-01

1.李艷娜，(1982,10--)，女，漢族，河南西華縣人。本科學歷，河南省周口市西華縣人民醫院職工，現西華縣人民醫院檢驗科工作。2.馬靈筠 通訊作者，女 河南科技大學教授，碩士生導師，從事生物化學與分子生物學教學與研究