基因疫苗黏膜免疫及其機制的研究進展

秦妍 管曉燕,2 綜述 白國輝,2 劉建國,2 審校

(1.遵義醫學院口腔醫學院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等高校口腔疾病研究特色重點實驗室遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

基因疫苗黏膜免疫及其機制的研究進展

秦妍1管曉燕1,2綜述 白國輝1,2劉建國1,2審校

(1.遵義醫學院口腔醫學院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等高校口腔疾病研究特色重點實驗室遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

基因疫苗； 黏膜免疫； 分泌型免疫球蛋白； 免疫佐劑

基因疫苗是將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統的載體質粒上，然后將重組質粒直接導入人或動物體內，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產生免疫應答。以達到預防疾病的目的。現已證實基因疫苗的有效性及安全性，但存在人體不能對基因疫苗進行有效的吸收以及機體對抗原的免疫耐受等不足，使其在人體中的免疫效果不佳。近年來，對基因疫苗的免疫策略、免疫效果及作用機制已進行了大量的研究。肌肉注射法因外源基因在體內的表達水平較低，免疫效果不夠理想。基因槍法、電穿孔等遞送技術的發展均顯著提高了基因疫苗的活體遞送效率，使基因疫苗免疫具有較強的誘導免疫應答的能力[1-2]。

口服、鼻腔黏膜滴注等黏膜免疫途徑因其給藥安全方便，價錢便宜，安全等優點[3]已受到廣泛關注。基因疫苗的黏膜免疫途徑不同，所產生的免疫應答強弱也不同。本文就基因疫苗的黏膜免疫的效果及其機制研究現狀做一綜述。

1 基因疫苗的黏膜免疫

黏膜免疫系統(MIS)是指廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體(唾液腺、淚腺、乳腺)處的淋巴組織，這些淋巴組織提供了天然的保護，防止病原體從機體表面進入，減少病原體散布到黏膜下組織、局部淋巴結、血液中。因此，黏膜免疫系統是機體抵抗病原體入侵的第一道免疫屏障，同時，黏膜免疫系統也是免疫系統中最大的部分，是執行局部特異性免疫功能的主要場所。

近年關于黏膜免疫的前沿研究提示,誘導黏膜局部免疫應答,將比常規的全身免疫更有助于清除黏膜感染病原體,預防感染的擴散和慢性化[4]。因此，基因疫苗研究的熱點主要在黏膜免疫。基因疫苗的黏膜免疫一般是將基因疫苗通過表面涂布或基因槍介導等方法進行免疫。致敏的淋巴細胞通過淋巴細胞歸巢，大約80%淋巴細胞再次返回到致敏的黏膜部位發揮免疫功能，即存在局部黏膜免疫反應[5]。另外，大約20%的淋巴細胞會進入其它黏膜部位參與其效應反應，稱共同黏膜免疫系統(CMIS)[6]。

基因疫苗接種后還可以誘導長期的免疫記憶[7]，許慶安等[8]在靶向防齲基因疫苗pGJA-P/VAX經鼻黏膜滴注途徑免疫BALB/c小鼠的實驗中證實，基因疫苗可在免疫原位和引流淋巴結存在6個月。

1.1 鼻腔滴注免疫 人類鼻黏膜免疫組織為韋氏環。鼻內pH值為6.5～7.0，鼻黏膜有很高的不規則度，其表面上皮細胞的微絨毛，提供了很大的膜面積，能提高鼻黏膜的吸收效率。且鼻腔中酶的活性和種類小于胃腸道，相較口服而言，基因疫苗不易受到酶的降解。據文獻[9]報道,與口服免疫相比，抗原經鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的四分之一，即鼻黏膜誘導免疫應答的抗原量低于口服免疫[10]，因此鼻黏膜免疫仍是研究的熱點。基因疫苗通過鼻腔滴注的方式免疫不僅能有效的誘導機體產生系統免疫和局部黏膜免疫反應[11]，同時，在鼻黏膜免疫中，由于抗原特異性淋巴細胞分布在機體共同黏膜免疫體系中，故可誘導產生共同黏膜免疫反應[12]。受抗原刺激后鼻黏膜免疫反應過程大致如下：鼻黏膜在抗原的刺激下，會啟動局部免疫調節，IgA沿上皮層彌散定居于黏膜下層各位點。同時，IgA陽性B細胞在抗原刺激下迅速由黏膜下淋巴管進入血液循環，受Th-2的調節，發育分化增殖后，移動到黏膜固有層(LP)中成為成熟IgA漿細胞和分泌型IgA漿細胞。繼而與上皮細胞表面上具有抗菌性能的分泌片段(SC)結合成為分泌型IgA(SIgA)，SC保護SIgA不被蛋白水解酶降解。隨后SIgA經上皮細胞轉運至上皮表面，并分泌到外分泌液中，與上皮細胞緊密結合，分布在黏膜表面發揮效應[13]，成為特異性免疫球蛋白抵抗外界抗原的第一道防線，其中除SIgA通過阻止黏附、溶解細菌、中和病毒、介導ADCC等機制從而為黏膜表面提供一個免疫屏障外，還可作為黏膜免疫疫苗的攜帶者，提供安全穩定的疫苗傳遞系統[14]。

SIgA是機體內分泌量最多的免疫球蛋白[15]，占黏膜相關組織產生的所有抗體的80%。而一般DNA疫苗經肌肉注射、皮內注射等途徑接種, 能產生高滴度的特異性IgG，但IgA水平較低。為更有效抵抗外界刺激，誘導SIgA成為最重要的途徑[16]。

盡管鼻黏膜免疫有很多優勢，但是由于疫苗在鼻腔內的低滲透性和短暫的停留時間，使基因疫苗不能很好的起到免疫作用。最新研究結果表明：通過殼聚糖包裹基因疫苗可以在黏膜免疫中顯著的提高特異性SIgA的富集[17]從而更好的發揮免疫效應，也可以通過微粒系統包裹基因疫苗或表面吸附使被吸附的基因疫苗經鼻黏膜免疫后產生明顯高于裸DNA的鼻黏膜免疫應答水平。相較于口服免疫，鼻腔免疫因避免了胃腸道酸性環境及酶對抗原的破壞、操作簡便易行而被廣泛采用。

1.2 口服免疫 基因疫苗也可以通過口服的方式進入機體發揮免疫應答，口服疫苗簡單易行，是最重要的免疫方式之一。M細胞是腸道黏膜免疫組織的功能性入口[18]，它是腸黏膜的誘導部位派伊爾集合淋巴結(PP)中的一種上皮細胞。PP結含有大量的免疫細胞，其中B細胞主要分布在淋巴濾泡，T細胞主要位于淋巴間區，同時也是黏膜免疫的主要誘導部位。有研究[19]證實M細胞的發展在腸內是依靠B淋巴細胞發揮其抗原提呈的作用。Neutra等[20]研究發現M細胞是大分子顆粒抗原進入上皮淋巴組織的主要途徑，它能特異性結合腸道大分子物質及微生物并通過受體介導包吞的方式將抗原轉運給黏膜下方的淋巴組織，然后抗原提呈細胞加以處理后呈遞給T淋巴細胞，同時通過促進Tfh細胞的分化能有效提高B淋巴細胞的活化[21]，B淋巴細胞分化增強，產生大量SIgA，再與B細胞合成IgA二聚體，穿過上皮細胞進入腸腔，啟動抗原誘導SIgA特異性黏膜免疫應答后與IgG一起發揮生物學效應[22]，隨后通過胸導管進入血液循環，進而到達各效應部位發揮免疫效應。因此，M細胞被稱為開啟黏膜免疫的門戶[18]。

此外，成功的黏膜免疫接種是依靠于將抗原提呈到黏膜免疫誘導位點。APC對激活免疫應答起關鍵性作用。因此，最新研究[23]證實通過生物的配體選擇設備人工培養的M細胞可以作為遞送靶抗原進入黏膜免疫系統的一種佐劑來增強免疫誘導。但在胃腸道中，胃酸的水解以及各種酶對基因疫苗的降解可能使基因疫苗過早失活，在機體中不能完全發揮免疫效應。有研究[24]報道,明膠對溫度穩定，可凍干，安全而無副作用，作為基因疫苗的佐劑不僅增強免疫應答，而且明膠可上調IgA應答。微粒系統中除了脂質體包裹的基因疫苗的免疫原性得到明顯提高，殼聚糖也作為重要的免疫佐劑可以提高抗體水平，增強免疫應答[25]。

1.3 肺部免疫 鼻黏膜免疫可以引發上呼吸道黏膜免疫，但很難誘導下呼吸道的黏膜免疫，通過肺部免疫可以有效抵抗下呼吸道感染。人體無固定的呼吸道相關淋巴組織的結構，但是抗原或者感染狀態能夠誘導呼吸道相關淋巴組織的形成。肺黏膜薄且血管豐富, 吸收面積達75 m2。在肺黏膜免疫中，基因疫苗顯著增強了肺黏膜局部特異性CD4+Th1細胞并誘導SIgA抗體的分泌[26]。水平游離的APC隨時可以抵抗外來感染，是肺部基因免疫的靶部位，其中肺部上皮細胞具有抗原遞呈的作用[27]。增強系統在黏膜誘導部位的停滯時間，可以增加DNA疫苗進入黏膜免疫組織的效率, 增強誘導免疫應答的效應。但免疫實施不便在呼吸道中，因此相較鼻滴及口服臨床應用較少。

2 小 結

基因疫苗通過黏膜免疫的方式誘發機體的免疫應答的應用越來越廣泛，不僅是因為黏膜免疫給藥方便、安全等特點，而且基因疫苗進入黏膜啟動的黏膜免疫應答比全身免疫更易清除黏膜上的病原體、預防機體感染擴散、增強機體抵抗力[28]。因此選擇通過不同的黏膜免疫方式進入機體，啟動黏膜免疫應答，但為讓基因疫苗更完整的到達黏膜上發揮其高效性，需借助佐劑作為載體包裹基因疫苗，使其更完整、安全的到達黏膜表面發揮黏膜免疫效應。但是在黏膜免疫機制中還存在許多問題，如SIgA的高效性是由于其分子的多聚體結構還是SC上額外的抗原決定簇，M細胞對病原體的轉運是特異性或非特異性仍然存在爭論，M細胞攝取抗原的機制等都尚未明確。

有關肺部免疫的相關機制的文章并不多。若要使基因疫苗更好更快更安全的進入機體通過黏膜免疫發揮其效應，這些問題必須得到解決，也有待進一步研究。

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