香葉木素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及周期阻滯的機制研究

楊陽，林滿洲，黃藝文，陳明

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001)

香葉木素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及周期阻滯的機制研究

楊陽，林滿洲，黃藝文，陳明

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001)

目的研究香葉木素對人肝癌HepG2細胞的增殖、凋亡及周期阻滯的影響并揭示其分子機制。方法MTT方法檢測不同濃度香葉木素對肝癌HepG2的細胞活力的影響；流式細胞術檢測不同濃度香葉木素處理對HepG2細胞周期阻滯及細胞凋亡的作用；Western blot檢測香葉木素處理對細胞p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21等細胞周期調(diào)節(jié)或細胞凋亡相關蛋白表達的調(diào)節(jié)。結(jié)果香葉木素能顯著抑制人肝癌HepG2細胞的增殖并且誘導細胞凋亡(P＜0.05)；流式細胞術對細胞周期檢測示：香葉木素處理HepG2細胞，使G0/G1期細胞比例顯著降低，而G2/M期細胞比例顯著升高(P＜0.05)。香葉木素可下調(diào)HepG2細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、cdc2、cyclinB1的蛋白表達，上調(diào)p53、p21、Bax、Bak,Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP等促凋亡蛋白。結(jié)論香葉木素在體外實驗能通過激活p53/Bcl-2細胞凋亡通路抑制人肝癌HepG2細胞的增殖及促進細胞凋亡，同時通過上調(diào)p53、p21下調(diào)cdc2、cyclinB1誘導細胞G2/M周期阻滯。

香葉木素；細胞凋亡；細胞周期阻滯；肝癌

肝細胞癌是常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌患者多有肝炎肝硬化背景，手術切除率低，為延長肝癌患者生存期，化學藥物治療仍是一個重要措施，臨床上化療藥物主要是通過誘導細胞凋亡來消除腫瘤細胞，其療效過程中如何與抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡的水平有關。

臨床上合成的化療藥物副作用大，選擇性差，開發(fā)新的及強大功效的天然藥物顯得十分重要，本研究中香葉木素(DIOS)是我國南方藥用植物的有效成分，其主要活性成分為黃酮類化合物，此類物質(zhì)具有抗氧化、抗感染、抗休克等多種作用，目前，有關研究報道關于香葉木素在誘導細胞凋亡方面的抗腫瘤作用機制的文章甚少。本實驗以此為切入點，選擇HepG2細胞作為實驗研究對象，通過細胞實驗研究香葉木素對人肝癌HepG2細胞活力、細胞凋亡率及細胞周期阻滯的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 人肝癌細胞系HepG2由廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心肝膽外科提供。用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 試劑 香葉木素(Sigma，美國)，AnnexinVFITC/PI細胞調(diào)亡檢測試劑盒(BD，美國)，人p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleav ed-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21抗體(CST，美國)，八甲基偶氮唑藍(MTT)及碘化丙啶(PI)染液(Sigma，美國)，細胞蛋白提取試劑盒(碧云天，中國)，PRMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)。

1.3 方法

1.3.1 細胞增殖檢測(MTT法) 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，消化，計數(shù)，用10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液配制成7.5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，孵育24 h待細胞貼壁后加入香葉木素(終藥物濃度分別為0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml、25 μg/ml、30 μg/ml)，每組設5個復孔，設置對照組及實驗組，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，棄上清液，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min待結(jié)晶充分溶解后在酶標儀490 nm波長處測定每孔吸光度(A)。計算細胞增殖抑制率，實驗重復3次。抑制率=(對照組A-試驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡變化 收集對照組和實驗組不同濃度香葉木素處理24 h后的HepG2細胞制成細胞懸液，加入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)離心5 min，洗滌細胞，重復一次。取100 μl細胞懸液，分別加入5 μl AnnexinV-FITC和PI混勻，避光放置20 min，上機前加入400 μl緩沖液，混勻后用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.3.3 檢測細胞周期的變化 取對數(shù)生長期的HepG細胞(4.5×103個/ml的濃度，3 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后)，對照組進行換液，實驗組給予香葉木素(終濃度分別為0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)作用24 h后收集細胞，離心1 000 r/min×5 min，用預冷PBS洗滌后用70%乙醇固定過夜，離心除去乙醇，再用預冷PBS洗滌，PI染色，4℃避光孵育染色30 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期時相的分布，此實驗重復3次。

1.3.4 細胞周期蛋白p21、cdc2、cyclinB1及凋亡蛋白Bcl-2及Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak蛋白表達變化的檢測 收集對數(shù)生長期的HepG2細胞，按照細胞蛋白質(zhì)提取試劑盒的步驟提取細胞總蛋白，收集細胞，用BCA法測定蛋白含量，95℃變性10 min，上20 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h后，一抗4℃孵育24 h，二抗37℃孵育2 h，用TBST洗膜后進行化學發(fā)光檢測目的條帶的表達，實驗獨立重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，其中兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DIOS對HepG2細胞形態(tài)學的影響 倒置相差顯微鏡下觀察到：對照組細胞觸角纖細，生長旺盛，形態(tài)規(guī)則，細胞輪廓清晰，大小均一，折光度強，貼壁良好。經(jīng)香葉木素處理后的實驗組可見HepG2細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞形態(tài)變圓，細胞間隙增大，部分細胞呈漂浮狀態(tài)或貼壁不牢，細胞碎片隨濃度的增大而增多，且隨藥物濃度增加，細胞數(shù)明顯減少，見圖1。

圖1 不同濃度香葉木素(0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml)處理肝癌HepG2細胞24 h后光學顯微鏡觀察

2.2 DIOS對HepG2細胞活力的影響 香葉木素能夠抑制HepG2細胞的活力，且具有時間濃度依賴性(P＜0.05)，見圖2。

圖2 香葉木素作用HepG2細胞不同時間的細胞活力

2.3 DIOS對HepG2細胞凋亡的影響 香葉木素可促使HepG2細胞凋亡，且隨香葉木素藥物濃度的增加，早期凋亡及晚期凋亡的細胞數(shù)逐漸增加且具有一定的濃度依賴性(P＜0.05)，見圖3。

圖3 不同濃度香葉木素作用HepG2細胞24 h后誘導肝癌HepG2細胞的凋亡率

2.4 DIOS對HepG2細胞周期的影響 香葉木素可促使HepG2細胞凋亡，且隨香葉木素藥物濃度的增加，早期凋亡及晚期凋亡的細胞數(shù)逐漸增加(P＜0.05)，細胞周期結(jié)果顯示導致G0/G1期細胞數(shù)比例降低，G2/M期細胞數(shù)比例升高，且具有一定的濃度依賴性(P＜0.05)，見圖4。

2.5 DIOS對HepG2細胞Bcl-2、Bax、Bad、cdc2、p21、p53、cyclinB1、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP蛋白的影響 隨著香葉木素藥物濃度的增加，Bax、Bak、Cleved-capase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、p21、p53蛋白表達增高，Bcl-2、cyclinB1、cdc2蛋白表達下調(diào)，見圖5。

圖4 不同濃度香葉木素對HepG2細胞周期的影響

圖5 不同濃度香葉木素作用HepG2細胞24 h后周期蛋白及凋亡蛋白的表達

3 討 論

我國肝癌發(fā)病率高，大多數(shù)患者有肝硬化基礎，約70%的患者失去手術切除機會，故在肝癌綜合治療中化療占據(jù)著重要的地位，目前常用的化療藥物對肝細胞肝癌療效欠佳，副作用大，尋求療效好、副作用低的天然藥物具有很重要的科學與應用價值[1]。

香葉木素存在自然界的草本藥物中，它是我國南方藥用植物[Striga asiatica(L.)O.Kuntze(玄香科，Scrophulariaceae)]的有效成分，含有香葉木素的Dianthus versicolor Fisch曾作為傳統(tǒng)蒙古藥材用于治療肝細胞惡性腫瘤等疾病。其主要的藥物活性成分為黃酮類化合物，此類物質(zhì)具有抗活性氧自由基、抗感染、抗腫瘤等多種奇特功效；而香葉木素是較為特殊的一種黃酮類化合物，它含有一種抑制人類肝細胞CYP1A酶活力的天然黃酮類化合物，具有抗誘變和抗變應特性[2]。香葉木素對于抑制腫瘤細胞的生長及侵襲的細胞實驗研究甚少，因此深入研究香葉木素對腫瘤細胞的周期阻滯及細胞凋亡作用機制為研發(fā)新型抗癌藥物更具有科研意義。

Cdc2(Cyclin-dependent kinases1，CDK1)生物學上稱為細胞周期蛋白依賴性激酶1，是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Cdc2能促使真核細胞周期G2/M期檢測點起正性調(diào)節(jié)作用，它與細胞色素B1(cyclinB1)相互作用形成有絲分裂促進因子復合物，促進細胞進入M期。有研究表明，cyclinA和Cdc2的表達能抑制cyclinB/Cdc2復合體的形成，而cyclinB/Cdc2復合體在細胞進入有絲分裂過程中發(fā)揮了重要的作用。而該研究表明香葉木素能下調(diào)Cdc2及cyclinB1的蛋白表達，從而促使肝癌HepG2細胞的細胞周期阻滯于G2/M期。香葉木素同樣能夠通過激活p53通路調(diào)控p21周期蛋白的高表達，而p21周期蛋白能抑制cdc2表達，從而促使細胞周期阻滯于G2/M期[3]。

本實驗中通過倒置相差顯微鏡觀察到香葉木素能夠明顯誘導人肝癌HepG2細胞的凋亡，且通過MTT實驗進一步說明香葉木素對人肝癌HepG2細胞的活力有明顯的抑制作用。而其后的流式細胞術檢測香葉木素處理后的肝癌細胞將進一步證明隨著香葉木素藥物濃度的增加與人肝癌HepG2細胞的凋亡數(shù)呈正相關[4]。而實驗最后的Western blot的結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、Bcl-2、Bax、Bak、Cleaved-PARP、Cleavd-caspase8、Cleaved-caspase3高表達進一步證明了香葉能通過p53/線粒體通路誘導細胞凋亡。

Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物，是細胞存活促進因子，Bcl-2為細胞凋亡過程中的原癌基因之一。Bcl-2蛋白家族參與細胞線粒體途徑凋亡調(diào)控，Bcl-2蛋白家族可分為凋亡抑制蛋白和促細胞凋亡蛋白兩大類。其中Bcl-2是抑制細胞凋亡蛋白，Bax是典型的促細胞凋亡蛋白，而Bax與Bcl-2相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控這細胞凋亡這一過程，而本實驗中發(fā)現(xiàn)香葉木素對HepG2細胞的Bcl-2家族蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)香葉木素能夠通過線粒體通路誘導Bcl-2蛋白的低表達，增強Bax凋亡促進蛋白的高表達，且Bax/Bcl-2比值逐漸增大，這一現(xiàn)象進一步闡明香葉木素能夠通過線粒體途徑的Bcl-2蛋白家族誘導細胞凋亡[5]。

在維持DNA的穩(wěn)定性和完整性的過程中，PARP (聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)是DNA損傷的一個重要敏感感受器。Caspase-3在正常細胞內(nèi)以無活性酶原形式存在于胞漿中，當細胞凋亡程序被激活，形成兩個小亞基和大亞基，隨之導致細胞的凋亡。而PARP是細胞凋亡的最終執(zhí)行者，通過外源性及內(nèi)源性線粒體途徑啟動細胞凋亡，細胞的最終凋亡也反饋性的激活Caspase-3的表達。因此，在生物學上一致認為Caspase-3的活化是細胞凋亡發(fā)生的重要標志。若DNA損傷嚴重且無法修復時，以底物形式參與凋亡從而誘發(fā)細胞生物學的改變[6]。而PARP是通過Caspase-3的活化來誘導細胞的最終凋亡，也是凋亡進程中的最后一階段。該研究中發(fā)現(xiàn)香葉木素能隨著濃度的增加促使Cleaved-PARP表達顯著上升，且在這一過程中Cleaved-caspase3表達顯著上升，與Cleaved-PARP的變化一致[7]。

綜上所述，香葉木素通過p53及線粒體凋亡通路調(diào)控Bcl-2表達的下調(diào)，上調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak，在上述體外實驗證明香葉木素能以時間-濃度效應抑制人肝癌HepG2細胞的活力、促進細胞凋亡，影響細胞周期蛋白的表達從而促使細胞周期阻滯于G2/M期，促使肝癌細胞HepG2細胞的生長阻滯。因此，香葉木素是一種潛在的肝癌化療候選藥物，且未來實驗對香葉木素如何影響細胞周期蛋白的表達將作進一步探討。

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Promoting effect of Diosmetin on the cell cycle arrest and cell apoptosis in HepG2 cell and its mechanism.

YANG Yang,LIN Man-zhou,HUANG Yi-wen,CHEN Ming.Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the effect of Diosmetin on cell proliferation,cell apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells,and dissect the underlying mechanism.MethodsMTT assay was performed to detect the viability of HepG2 cells under different levels of Diosmetin.The cell apoptosis rate and cell cycle arrest were analyzed by flow cytometry(FCM).Western blot was applied to measure the protein levels of P53, Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase8,Cleaved-PARP,Bak,cdc2,cyclinB1,P21.ResultsDiosmetin treatment on HepG2 cells significantly inhibited cell proliferation and induced cell apoptosis(P＜0.05).FCM results showed that Diosmetin treatment significantly promoted cell cycle arrest in G2/M phase in HepG2 cells(P＜0.05),with the proportion of cells in G0/G1phase significantly reduced.Besides,Diosmetin significantly downregulates Bcl-2,cdc2,cyclinB1,and up-regulated Bax,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase8,Cleaved-PARP,Bak,P53,P21.ConclusionDiosmetin inhibits HepG2 cell proliferation and induces cell apoptosis by activation of p53/Bcl-2 pathway.Meanwhile,Diosmetin treatment induces G2/M cell cycle arrest in HepG2 cell by down-regulation of cell cycle related protein cdc2,cyclinB1 and up-regulation of P53,P21.

Diosmetin;Cell apoptosis;Cell cycle arrest;Hepatocellular carcinoma

R735.7

A

1003—6350（2016）03—0354—04

2015-09-05)

陳明。E-mail：fykjk@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.03.004