丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制、致病及感染的影響分析

劉亞 明全

(1.宜昌市第三人民醫院醫保辦；2.宜昌市第三人民醫院肝病科，湖北 宜昌 443000)

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丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制、致病及感染的影響分析

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(1.宜昌市第三人民醫院醫保辦；2.宜昌市第三人民醫院肝病科，湖北 宜昌 443000)

目的 觀察丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制、致病及感染的影響。方法 按生物化學的方法進行，制備丙型肝炎病毒的RNA的轉錄體；根據培養的結果進行相關的檢測實驗，對相關的實驗結果進行整理、記錄和分析。結果 引入突變基因的表達數與原基因表達數沒有顯著的差異且兩組核心蛋白的表達水平無顯著差異；F蛋白的表達在腫瘤組織中要高于其他組織，表明在肝癌的形成與F蛋白有一定的相關性；含有單一突變的核心蛋白與野生型的核心蛋白在結構方面基本保持一致；F缺失型核心蛋白的二級結構有了較多的變化。結論 HCVF蛋白的缺失對病毒的翻譯和復制的過程沒有影響，對病毒的翻譯、復制和治病性的影響加大的是核心蛋白的二級結構。

丙型肝炎病毒； 核心蛋白； 病毒復制； F蛋白

丙型肝炎病毒的感染是導致慢性肝臟疾病的罪魁禍首，由此導致的感染可進一步發展成為肝硬化、脂肪肝和肝癌等重疾[1]。為進一步了解丙型肝炎病毒F蛋白是如何影響病毒的感染、致病和復制的過程的，本研究觀察了在F蛋白缺失的情況下病毒翻譯和復制的過程，并對其缺失后核心蛋白的二級結構是如何變化的做進一步的分析

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 QuikChang LinghrningSite-Directed Mutagenesis Kit [Stratagene公司(美國)];異丙基硫代半乳糖苷、5-溴4-氯3-吲哚-β-D半乳糖苷、NZ胺、酵母提取物；14 mL BD Falcon 聚丙烯管(上海雅怡科學實驗設備有限公司)；HCV NS5A 單克隆抗體(Charles M .Rice教授)，T7體外轉錄試劑盒M-MLV反轉錄酶(Promrga 公司)；胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、Alex488羊抗鼠熒光、FITC-羊抗人IgG、Lipofectamine 2000、RNA抽提試劑(美國invitorgen公司)。

1.2 細胞株和質粒構建 以試劑盒的說明進行定點突變引入試劑盒，以PFL-J6JFH1作為模版，引入突變的數量為5處，引入這些突變的目的在于終止已知的所有的F蛋白的復制，而這一過程并不改變HCV氨基酸的基因序列。

1.3 病毒RNA轉錄體制備 (1)線性化處理：通過XbaⅠ將質粒進行線性化的處理；(2)體外的轉錄：通過T7轉錄試劑盒進行；(3)純度和完整性檢測：試劑選擇體積比為25:1:24的苯酚、異戊醇和氯仿的混合液，然后用1.5%的瓊脂糖凝膠通過電泳對其純度和完整性進行檢測。

1.4 RNA轉錄體轉染和細胞培養 RNA的轉錄體的轉染：選用1 000 g的胰酶消化細胞，依次經過離心、分離、洗滌、重懸、稀釋、混勻和電擊(270 V、100 mΩ)等過程然后轉入恒濕恒溫箱(5%CO2、37 ℃)培養。細胞的培養：Huh7.5.1細胞在10%胎牛血清的DMEM培養液中，放置于5%CO2,37 ℃飽和濕度的培養箱培養，培養液中添加L-谷氨酰胺 2 mmol/mL，NEAA 0.1 mmol/L，鏈霉素 100 g/mL及青霉素100 U/m。

1.5 對PCR進行定量 將特異性引物引入HCV5`的非編碼區，進行轉染，72 h后對轉染細胞的總RNA或者是其上清RNA進行抽提，定量檢測細胞中的HCVRNA；對轉染細胞HCV RNA的濃度進行計算。

1.6 熒光觀察 將進行了轉染的細胞進行培養，首先接種到細胞培養板上(96孔細胞培養板)，然后放入培養箱(37℃、5% CO2)進行培養，培養完成后(約48 h)棄去上清液；向每孔加入約100 μL的甲醇，在-20 ℃放的環境中靜置約20 min；進行PBS洗滌，每次5 min，共3次；然后每孔中依次加入Triton X-100(100 μL，0.1%)、BSA、HCV患者血清(1∶100)、FITC-羊抗人(1∶100)或Alex488羊抗鼠熒光(1∶100)，然后進行避光哺育(1 h)，最后有熒光顯微鏡進行檢查并拍照。

1.7 病毒滴度檢測 對不同時間的轉然后的細胞上清液進行收集，取3 000 g左右進行離心分離，以達到去除其中細胞碎片的目的，之后與-80 ℃的環境進行保存。放入培養箱繼續培養，最后進行病毒滴度的檢測。

1.8 統計學方法 對研究的數據進行整理和校對，計量資料和技術資料的比較分別采用t檢驗和χ2檢驗，數據的整理和統計學分析分別選擇EXEL和SPSS16.0，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 引入突變基因與原基因表達數的比較分析 引入突變基因的表達數與原基因表達數差異無統計學意義，且兩組核心蛋白的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 F蛋白缺失對病毒致病性的影響 F蛋白的表達在腫瘤組織中要高于其他組織，表明在肝癌的形成與F蛋白有一定的相關性。

2.3 RNA的二級結構對病毒翻譯、復制過程及致病性的影響 含有單一突變的核心蛋白與野生型的核心蛋白在結構方面基本保持一致；F缺失型核心蛋白的二級結構有了較多的變化。

3 討 論

F蛋白是由HCV的核心的編碼序列經過移碼編碼產生的，一般認為編碼核心蛋白與編碼F蛋白的序列是相互重疊的。基因的內部翻譯的起始位點被認為是密碼子26[2-3]。Core+1/S蛋白(最短的F蛋白)的編碼區位是核心蛋白編碼區(85～87)的一段基因， 該區域被認為是F蛋白的進行內部翻譯的起始位點[4]。目前為止，發現的移碼蛋白已有多種，但是對其生物功能的認識還是十分的不清晰[5-6]。為了更深入的了解F蛋白的生物功能，明確其是如何影響HCV的復制、翻譯和致病過程的，該研究對野生型J6JFH1和自我構建的突變體(J6JFH1/△F)進行了對比和分析。結果顯示突變體HCV的RNA的蛋白質的表達水平與之前相比降低了很多，與此同時，病毒的RNA的水平也下降明顯(下降近95%)，上清液中的病毒顆粒的數量也明顯減少[7]。將自我制備的突變體的RNA轉染到Huh7.5.1細胞上，對細胞內病毒蛋白的表達性進行檢測，對上清病毒RNA和病毒的滴度進行檢測，結果表明，野生型和突變體之間無明顯差異[8]。由于引入突變可能引起HCV核心基因的二級結構的改變，而核心基因的二級結構能夠對HCV RNA的復制和翻譯的過程造成影響；進一步對核心基因的二級結構進行分析，結果表明，病毒的翻譯和復制的過程受到核心基因二級結構變化的影響，具體的過程有待進一步的研究。

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