Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸多態性與肺癌易感性研究

陳賢華，胡宏波，孫秀娟，劉大鷹，馮金

(柳州市柳鐵中心醫院檢驗科1、病理科2、呼吸內科3，廣西 柳州 545007)

Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸多態性與肺癌易感性研究

陳賢華1，胡宏波1，孫秀娟2，劉大鷹3，馮金1

(柳州市柳鐵中心醫院檢驗科1、病理科2、呼吸內科3，廣西 柳州 545007)

目的 探討Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸多態性改變與肺癌發生的關系。方法基因分型用TaKaRa的MightyAmp DNA聚合酶法，分別檢測36例肺癌患者(癌癥組)及其癌旁正常組織(對照組)的Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C分布，運用χ2檢驗和Armitage′s趨勢檢驗等分析其與肺癌發生的相關性。結果兩組標本經Hardy-Weinberg平衡檢測，對照組在Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C基因型觀測(理論)頻數為34、1、1(33.06、2.88、0.06)，差異有統計學意義(P=0.042)，癌癥組的基因型觀測(理論)頻數為33、1、2(33.17、4.56、0.17)，差異有統計學意義(P=0.003)；Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸多態性與肺癌易感性的Armitage′s趨勢檢驗差異無統計學意義(χ2=0.31，P=0.581)。結論對照組接近符合Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態，而肺癌組不符合該規律；Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸位點多態性可能與肺癌發生不具有相關性。

肺癌；Reprimo；多態性；相關性

癌現在是臨床最常見惡性腫瘤之一。在相同致癌條件下，暴露人群只有一些人會得肺癌，病因學研究表明不同個體對致癌物的易感性有差異；分子流行病學研究提示遺傳傾向在大多數肺癌中可能起到一個重要作用[1]；Fasching等[2]發現人群中許多基因都存在遺傳多態性，并在個體腫瘤易感性中起重要決定作用。因此，單核苷酸多態性改變可能導致Reprimo基因3′非翻譯區824位點基因轉錄水平的變化，進而影響腫瘤發生發展。本研究旨在探討人群中Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C與肺癌易感性之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 36例肺癌患者(肺癌組)和其癌旁正常組織(對照組)標本取自2006-2010年本院和外院手術切除或纖支鏡取得的肺(癌)組織，質地均一，經10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋，室溫存檔至今；對照組標本為同一患者遠端配對正常肺組織(距腫瘤邊界灶≥3 cm)。

1.2 提取DNA方法 選取TaKaRa DEXPAT?試劑。組織切片為5 μm，加入0.3 mlTaKaRa DEXPAT?提取液，恒溫100℃加熱10 min，12 000 rpm，4℃離心10 min形成分層，吸取水層就可以得到PCR擴增用DNA。具體操作按說明書進行。

1.3 擴增試劑 選取TAKARA試劑MightyAmp DNA Polymerase，擴增Reprimo基因，引物由上海生工合成，堿基序列為R1：5′-AGAGGGCGATTAGGGCGC AG-3′；R2：5′-AGAGGGCGATTAGGGCGCAC-3′，R3：5′-AGGAGAAGAGTGGGAGCGC-3，R1R3針對824位點為G的片段，擴增產物249 bp；R2R3針對824位點為C的片段，擴增產物249 bp。

1.4 PCR反應體系 反應體系為25 μl：2×PCR Buffer(MightyAmp DNA Polymerase)12.5 μ l，模板DNA4 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，重蒸水7 μl，酶(5 U/μl)0.5 μl。反應條件：98℃預變性5 min以后，擴增溫度98℃10 s、60℃15 s、68℃60 s循環，循環次數分別為40次，最后68℃延伸4 min；PCR擴增目的基因DNA的檢測：取10 μl PCR產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 統計學方法 采用χ2檢驗評估病例組和對照組中各基因型的分布差異，t檢驗評估年齡組差異，所用統計軟件為SPSS15.0，以α=0.05為檢驗水準；哈迪一溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)檢測、Armitage′s趨勢檢驗、計算比值比(OR)及95%可信區間(CI)，利用在線軟件(http∶//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/ hwa1.pl)進行計算，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象基本資料 肺癌患者36例，其中大細胞癌組10例，腺癌組9例，鱗癌組7例，小細胞癌組10例；男性26例，平均年齡(58.81±10.42)歲，女性10例，平均年齡(54.40±9.58)歲，差異無統計學意義(t= 1.161，P=0.254)。

2.2 Reprimo基因分型 Reprimo基因3′非翻譯區824G＞C位點各個基因型在瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶分別為GG：249 bp；CC：249 bp，具體見圖1。

圖1 Reprimo基因3′非翻譯區824G＞C位點基因型條帶圖譜

2.3 對照組和肺癌組經Hardy-Weinberg平衡檢測結果 各組在Reprimo基因3′非翻譯區824G＞C位點基因型頻數(觀測/理論)GG、GC、CC和Hardy-Weinberg檢驗情況見表1，精確檢驗(自由度=1)，P≥0.05，判斷其基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。

表1 各組標本的Hardy-Weinberg平衡檢測結果

2.4 Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸多態性與肺癌易感性的Armitage′s趨勢檢驗 與G等位基因相比，C等位基因的患者肺癌發病率更低；與GG基因型相比，GC、CC及GC+CC基因型的患者肺癌發病率明顯降低；Armitage′s趨勢檢驗差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 Reprimo基因3′非翻譯區824位點各基因模型Armitage′s趨勢檢驗

3 討 論

肺癌在國內發病率及患病絕對人數均占全世界的第一位，早期肺癌的5年生存率可達90%，但由于早期無特異性癥狀，很難被早期發現。肺癌早期診治仍是醫學界的一個重大課題。

基因Reprimo是一種胞漿糖蛋白，由109個氨基酸組成，相對分子質量為12 kD，位于人類染色體2q23，可由細胞經X線照射后分離出。其作為p53基因的下游靶基因參與抑制細胞周期，機理可能是通過抑制Cdc2/cyclinB1以及Cdc2活性核轉位的途徑來調節細胞周期[3]。國內外研究Reprimo基因甲基化與腫瘤關系的論文很多，認為Reprimo基因甲基化與腫瘤發生、治療方面存在一定的相關性[4-6]。而Reprimo基因多態性與腫瘤關系論述較少，Ye等[7]研究發現Reprimo基因3′非翻譯區的824位點存在G＞C多態性，并用Hardy-weinberg平衡檢驗高加索人群，證明該位點基因型和等位基因頻率分布均符合遺傳平衡規律。Beasley等[8]在研究Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C多態性與大腸癌的關系時，發現健康組和大腸癌組在該位點也符合遺傳平衡規律，憩室病組不符合此規律；824位點G＞C多態性與大腸癌不存在相關性。

本研究發現，肺癌對照組在Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C基因分布不符合Hardy-weinberg平衡(P=0.042)，但其P值很接近0.05，可認為其接近符合遺傳平衡規律；肺癌組不符合該規律(P=0.003)；但肺癌組中大細胞癌組、腺癌組、鱗癌組符合該規律(P＞0.05)，小細胞癌組不符合該規律(P＜0.05)；各肺癌組之間的基因型差異無統計學意義(χ2=5.949，P=0.429)。不符合遺傳平衡規律的原因可能是基因發生突變引起，也可能是基因分型錯誤所致，還可能是樣本含量不足。本實驗結果顯示，C等位基因的患者肺癌發病率低于G等位基因的患者，GC、CC及GC+CC基因型的患者肺癌發病率比GG基因型的也明顯降低，但差異均無統計學意義(P＞0.05)；Armitage′s趨勢檢驗，差異無統計學意義(P＞0.05)，說明Reprimo基因3′非翻譯區824位點基因改變，肺癌發生率不呈線性增加的趨勢。

綜上所述，Reprimo基因3′非翻譯區824位點G＞C單核苷酸多態性與肺癌的發生不具有顯著的相關性(P＞0.05)。本文不足：本實驗樣本含量有限，而且該位點并不能代表Reprimo基因所有功能性位點，在后續研究中有必要增加樣本含量和其他位點研究，以期明確Reprimo基因單核苷酸多態性改變在肺癌發生發展中的作用。

[1]Liu G,Zhou W,Christiani DC.Molecular epidemiology of non-small cell lung cancer[J].Semin Respir Crit Care Med,2005,26(3)∶265-272.

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[3]Ohki R,Nemoto J,Murasawa H,et al.Reprimo,a new candidate mediator of the p53-mediated cell cycle arrest at the G2 phase[J].Biol Chem,2000,275(30)∶22627-22630.

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[5]李穎,易默,何小勤.Reprimo和hMLH1基因甲基化在胃癌早期診斷價值的研究[J].現代檢驗醫學雜志,2015,30(3)∶53-59.

[6]羅峻,朱尤慶,楊桂芳,等.S100A2、Reprimo在胃腺癌中的表達及其臨床意義[J].中華實驗外科雜志,2008,25(6)∶754-755.

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Association of Reprimo gene 3′-untranslated region 824 G＞C polymorphism with lung cancer.

CHEN Xian-hua1, HU Hong-bo1,SUN Xiu-juan2,LIU Da-ying3,FENG Jin1.Department of Clinical Laboratory1,Department of Pathology2, Department of Respiratory Medicine3,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the relationship between 824 G＞C polymorphism in the 3′-untranslated region of Reprimo gene and lung cancer.MethodsGenotyping was performed by MightyAmp DNA Polymerase(Ta-KaRa)with samples of cancerous tissues(cancer group)and pericarcinous tissues(control group)from 36 lung cancer patients to detect the 824 G＞C polymorphism in the 3′-untranslated region of Reprimo gene.χ2test and Armitage′s trend test were applied to analyze the correlation between 824 G＞C polymorphism and the risk of lung cancer.ResultsAccording to Hardy-Weinberg equilibrium detection,824 G＞C genotype observation(theory)frequency was 34,1,1 (33.06,2.88,0.06)in the control group(with statistically significant difference,P=0.042)and 33,1,2(31.17,4.56,0.17) in the cancer group(with statistically significant difference,P=0.003).Armitage′s trend test revealed no significant correlation between 824 loci G＞C single nucleotide polymorphisms and susceptibility to lung cancer(χ2=0.31,P=0.581).ConclusionThe control group was nearly accord with Hardy-Weinberg genetic equilibrium state,but lung cancer group was not.No association was found between 824 G＞C polymorphism in the 3′-untranslated region of Reprimo gene and lung cancer.

Lung cancer;Reprimo;Polymorphism;Association

R734.2

A

1003—6350（2016）03—0348—03

2015-09-04)

廣西壯族自治區衛生廳計劃課題(編號：Z2010138)；廣西壯族自治區柳州市科學技術局技術研究與開發計劃課題(編號：2011J0302031)

陳賢華。E-mail：chenren200@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.03.002