利用靶擬態合成和Gateway技術構建水稻miR164c沉默突變體

吳多++周艷++宋傲群++劉瀏++史筱靚++姜孝成

摘 要 以水稻基因組DNA為模板， PCR擴增得到與miR399互補的OsMIM399后，改造成與miR164c互補的靶擬態序列OsMIM164c，經測序分析后連入pGWC載體，獲得入門載體pGWCOsMIM164c；利用Gateway技術，將入門載體pGWCOsMIM164c經LR反應連接到植物表達載體GCS中，獲得GCSOsMIM164c表達載體，經農桿菌介導將該表達載體導入水稻品種Kasalath的愈傷組織中，組織培養后獲得再生植株并進行目的基因的PCR鑒定， Real Time PCR方法檢測陽性突變體植株中miR164c的表達量. 研究結果表明，miR164c在突變體植株中的表達量顯著低于野生型，說明miR164c沉默突變體構建成功.

關鍵詞 靶擬態； Gateway技術； miR164c； 沉默突變體； 水稻

中圖分類號 Q785； Q943.2 文獻標識碼 A 文章編號 10002537（2016）01002406

Construction of Silence Mutant of miR164c in Oryza Sativa L.

by Target Mimicry and Gateway Technology

WU Duo**， ZHOU Yan**， SONG Aoqun， LIU Liu， SHI Xiaoliang， JIANG Xiaocheng*

（College of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract Genomic DNA of rice （Variety ZR02） was used as template to amplify OsMIM399 by PCR which has a region complementary to miR399， and OsMIM399 was reconstructed into the target mimicry OsMIM164c with a region complementary to miR164c. After sequencing， the right fragment was ligated into pGWC vector to construct pGWCOsMIM164c， and OsMIM164c was then transferred to the plant expression vector GCS to prepare GCSOsMIM164c through LR reaction. GCSOsMIM164c was finally transformed into rice Kasalath calli by the improved Agrobacteriummediated method and regenerated plantlets were obtained by tissue culture technique. After target gene OsMIM164c was identified by PCR， the expression of miR164c in positive mutants was analyzed by RT qPCR. The results showed that the expression of miR164c exhibited a distinct reduction in mutant plants compared to the wild type， indicating that the miR164c silence mutant has successfully been prepared.

Key words target mimicry； gateway technology； miR164c； silence mutant； rice

microRNA（miRNA）是一類長度為20～24 nt的非編碼小分子RNA，在轉錄后水平對靶mRNA進行剪切或抑制其翻譯，繼而調控靶基因的表達[1]. 每個miRNA家族中有多個成員，各成員核苷酸序列極其相似，對基因的調控作用表現出冗余效應. 因此，沉默其中一個miRNA很難出現預期的表型；通過常規的構建基因沉默載體方法來研究miRNA的功能喪失（loseoffunction）存在很大困難[2]. 2007年，Jose等在研究低磷誘導下miR399的功能時，發現一個非編碼的基因IPS1，它是TPS1大家族中的一員. TPS1家族成員都含有一段非保守的短開放閱讀框（ORF），具編碼四肽（MetAlaIlePro）的功能[36]；另一個共同特征是含有一個保守的23 bp的基序，該基序與miR399可形成不完美配對，即配對時在第10～11座位錯配而出現一個突起環，致使IPS1可以與miR399特異結合而不被切割，因此，過表達IPS1可導致miR399的功能沉默，從而導致miR399的靶基因PHO2的表達上調. Jose把這個抑制miRNA活性的機制稱為……