丁酸梭桿菌VPI 3266甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶的克隆、表達(dá)

裴建軍，屈依然，殷冉，陳安娜，趙林果（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 0037；江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 0037）

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丁酸梭桿菌VPI 3266甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶的克隆、表達(dá)

裴建軍1，2，屈依然1，2，殷冉1，2，陳安娜1，2，趙林果1，2
（1南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；2江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

摘要：對丁酸梭桿菌VPI 3266的1,3-丙二醇代謝途徑關(guān)鍵酶甘油脫水酶（DhaB）與1,3-丙二醇氧化還原酶（DhaT）進(jìn)行了研究。甘油脫水酶基因dhaB全長3315bp，編碼兩個(gè)蛋白亞基，分別為甘油脫水酶的核心酶和脫水酶的再激活酶。前者全長2367bp，編碼788個(gè)氨基酸，后者全長918bp，編碼305個(gè)氨基酸。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，使其在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。1,3-丙二醇氧化還原酶基因dhaT全長1166bp，編碼388個(gè)氨基酸，屬于NADP依賴的離子激活的醇脫氫酶家族III。通過IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，酶活達(dá)到5.2U/mL。并通過Ni親和柱獲得了電泳純的蛋白。蛋白相對分子質(zhì)量為4.19×104。該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值為10.0，在pH值 8.5～10.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在45℃保溫2h，酶活還殘存50%。該酶以1,3-丙二醇為底物，在生理?xiàng)l件下的Vmax和Km分別為29.2U/mg 和19.8mmol/L。

關(guān)鍵詞：丁酸梭桿菌；甘油脫水酶；1,3-丙二醇氧化還原酶；重組表達(dá)

第一作者：裴建軍（1979—），男，副教授。E-mail peijj2000@sina.com.cn。屈依然（1993—），女，本科。屈依然對本文的貢獻(xiàn)等同于裴建軍，同為第一作者。聯(lián)系人：趙林果，博士，教授。E-mail lg.zhao@163.com。

Cloning and expression of glycerol dehydratase and 1,3-propanediol dehydrogenase from Clostridium butyricum VPI3266

PEI Jianjun1，2，QU Yiran1，2，YIN Ran1，2，CHEN Anna1，2，ZHAO Linguo1，2
（1College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，Jiangsu，China；2Jiangsu Key Lab of Biomass Based Green Fuels and Chemicals，Nanjing 210037，Jiangsu，China）

Abstract：Glycerol dehydratase and 1,3-propanediol dehydrogenase are the key enzymes for 1,3-propanediol metabolism in Clostridium butyricum VPI3266. The gene dhaB consisted of a 3315bp fragment encoding two proteins subunits，glycerol dehydratase and its activator protein，respectively. The former consisted of 2367bp encoding 788 amino acids，which belonged to family gly-Radical. The latter consisted of 918bp encoding 305 amino acids，which belonged to family Radical-SAM. The activity of glycerol dehydratase was determined by expressing dhaB in E. coli. 1,3-PD dehydrogenase gene dhaT consisted of 1166bp encoding 388 amino acids with calculated molecular mass of 4.19×104. The activity of recombinant β-glucosidase was 5.2U/mL in LB medium by IPTG induction. The optimal activity was achieved at pH=10.0 and 50℃. The purified enzyme was stable over pH range of 8.5—10.0，and had a 2h half-life at 45℃. The Vmaxand Kmfor 1,3-propanediol was 29.2U/mg and 19.8mmol/L，respectively.

Key words：Clostridium butyricum; glycerol dehydratase; 1,3-propanediol dehydrogenase; recombinant expression

1,3-丙二醇（ 1,3-propanediol，簡稱1,3-PDO）是一種重要的化工原料，它不僅是良好的溶劑、抗凍劑、保護(hù)劑，而且還可以作為生產(chǎn)聚醚、聚酯和聚氨酯的單體，是具有廣闊應(yīng)用前景的化工原料之一[1-2]。1,3-PDO的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)法不僅消耗了大量的資源，設(shè)備投資較大，而且造成環(huán)境污染。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PDO具有選擇性好、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)而越來越受到重視。

目前，能夠進(jìn)行 1,3-PDO轉(zhuǎn)化的菌主要有腸道細(xì)菌中的肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏檸檬桿菌（Citrobacter freundii）以及 Enterobacter agglomerans，乳桿菌屬的短乳桿菌（Lactorbacillus brevis）和布氏乳桿菌（Lactorbacillus buchneri）、梭菌屬的丁酸梭桿菌（Clostridium butyricum）和巴氏梭狀芽孢桿菌（Clostridium pasteuianu）。其中肺炎克雷伯氏桿菌、丁酸梭桿菌和弗氏檸檬桿菌有較高的1,3-PDO轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度，是研究較多的3種菌[3-5]。微生物代謝甘油生成1,3-PDO，需要甘油脫水酶（EC 4.2.1.30）和1,3-丙二醇氧化還原（EC 1.1.1.202）的參與。甘油脫水酶催化甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛，是甘油生產(chǎn)1,3-PDO的一個(gè)關(guān)鍵酶。大部分微生物來源的甘油脫水酶激活需要維生素B12，因此，在培養(yǎng)過程中需添加維生素B12[6-8]。1,3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛生成1,3-PD，同時(shí)消耗NADH生產(chǎn)NAD+，微生物通過該反應(yīng)步驟消耗還原力NADH，使微生物細(xì)胞內(nèi)的還原力達(dá)到平衡[9-11]。

丁酸梭桿菌VPI 3266能高效催化甘油生成1,3-PDO，而且在培養(yǎng)過程中無需添加維生素B12。本文將對丁酸梭桿菌VPI 3266的1,3-丙二醇代謝途徑關(guān)鍵酶甘油脫水酶與1,3-丙二醇氧化還原酶基因分別進(jìn)行克隆、表達(dá)及定性研究。

1　材料與方法

1.1菌種

丁酸梭桿菌Clostridium butyricum VPI3266購買自德國微生物菌種保藏中心DSMZ （www.dsmz.de）。大腸桿菌JM109購于Promega公司。

1. 2酶和化學(xué)試劑

Ex-taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶、DNA分子量Marker均購自大連TaKaRa生物公司，T4 DNA ligase購自NEB公司，實(shí)驗(yàn)所使用的酵母粉 （yeast extract）購自O(shè)xoid公司，變性標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自Promega公司，瓊脂糖購自BBST公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自金慶祥生物試劑有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3基因提取操作

基因組的提取，DNA片段的分離，感受態(tài)細(xì)胞的制備等均按照分子克隆技術(shù)[12]。

1.4培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)采用含有50μg/mL卡納霉素的LB培養(yǎng)基（蛋白胨 10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L）培養(yǎng)。Clostridium butyricum VPI3266培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法按照文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行[5]。

1.5重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.5.1重組質(zhì)粒πΕΤ?28α?δηαΤ的構(gòu)建

根據(jù)NCBI已經(jīng)公布的丁酸梭桿菌VPI 1817的dhaT基因序列設(shè)計(jì)引物如下。dhaT-1：5’-GGGCCATGGAGAGAATGTATGATTATTTAGT-3’，dhaT-2：5’-GGGCTCGAGATAAGCAGCCTTAAAAATA T-3’。下劃線分別表示的是Nco I和Xho I的限制性酶切位點(diǎn)。以丁酸梭桿菌VPI 3266的基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物割膠回收后用Nco I/Xho I雙酶切克隆到pET-28a，得到重組質(zhì)粒pET-28adhaT。

1.5.2重組質(zhì)粒pET-28a-dhaB的構(gòu)建

根據(jù)NCBI已經(jīng)公布的丁酸梭桿菌VPI 1817的dhaB基因序列設(shè)計(jì)引物如下。dhaT-1：5’- dhaB-1：GGGCCATGGAG ATAAGTA AAGGATTTAGTAC-3’，dhaT-2：5’- GGGCTCGAGCTCAGCT CCAATTGTGC-3’。下劃線分別表示的是Nco I和Xho I的限制性酶切位點(diǎn)。以丁酸梭桿菌VPI 3266的基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物割膠回收后用Nco I/Xho I雙酶切克隆到pET-28a，得到重組質(zhì)粒pET-28a-dhaB。

1.61,3-丙二醇氧化還原酶酶活性測定[9]

1,3-丙二醇氧化還原酶（DhaT）的作用是還原3-羥基丙醛（3-HPA）為1,3-丙二醇。但是3-HPA不穩(wěn)定且未商品化，故采用逆反應(yīng)測量該酶活力。按照文獻(xiàn)報(bào)道的轉(zhuǎn)化系數(shù)3.95來計(jì)算得到該酶還原底物3-HPA的反應(yīng)速率。

反應(yīng)液總體積為200μL,包括30mmol/L硫酸銨、2mmol/L的二硫蘇糖醇、100mmol/L的1,3-丙二醇、2mmol/L NAD，100mmol/L pH 10.0的碳酸鉀緩沖溶液以及適量的待測酶液。50℃水浴5min，在340 nm下測量吸收值。定義一個(gè)酶活單位（U）是在該條件下1min內(nèi)消耗1μmol底物所需要酶量。

1.7甘油脫水酶（DhaB）活性測定[4]

反應(yīng)液體積1mL，含有50mmol/L的氯化鉀、0.2mol/L的1,3-丙二醇、0.035mol/L磷酸鉀緩沖液（pH=7.0）和適量細(xì)胞抽提液。37℃下保溫10min，而后加入1mL的0.1mol/L檸檬酸鉀緩沖液（pH值3.6）和0.5mL的0.1%的MBTH溶液，在37℃下繼續(xù)保溫15min。最后加入1mL蒸餾水，于305nm處測量光吸收值。定義一個(gè)酶活單位（U）是在該條件下1min內(nèi)生成1μmol 1,3-丙二醇所需要的酶量。

1.8酶學(xué)性質(zhì)分析

最適反應(yīng)溫度的測定：在25～60℃范圍內(nèi)，每隔5℃，分別測定酶活。以酶活最高為100%，計(jì)算相對酶活。

最適反應(yīng)pH值：在不同的pH值下測定酶活，以酶活最高為100%，計(jì)算相對活性。在pH=8～11.5范圍內(nèi)，緩沖液是0.1mol/L碳酸鉀緩沖溶液。

溫度穩(wěn)定性：在相對穩(wěn)定的pH值下，使酶在某個(gè)溫度下保溫不同的時(shí)間，再測定相對酶活，以未溫育的酶活性為100%，確定酶的溫度穩(wěn)定性。

pH穩(wěn)定性： 酶在不同的pH值條件下放置相同的時(shí)間（冰上放置12h），分別測定殘留酶活性，與不保溫酶的酶活相比，計(jì)算百分比。

2　結(jié)果

2.1Clostridium butyricum VPI 3266的1,3-PDO氧化還原酶的克隆、表達(dá)及純化

1,3-PDO氧化還原酶催化3-羥基丙醛生成1,3-PDO，并氧化NADH，生成NAD+。1,3-PDO氧化還原酶可以解除3-羥基丙醛的積累對細(xì)胞影響。同時(shí)通過消耗NADH，使得細(xì)胞內(nèi)部的還原力水平處于正常水平，保持細(xì)胞處于良好的代謝狀態(tài)。由此可見，要提高1,3-PDO的產(chǎn)量，需要高活力的1,3-PDO氧化還原酶，同時(shí)需要調(diào)控細(xì)胞的還原力更多流向1,3-PDO。

根據(jù)同源性設(shè)計(jì)引物，以Clostridium butyricum VPI 3266基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1,3-PDO氧化還原酶基因dhaT的全序列。瓊脂糖電泳檢測結(jié)果表明，擴(kuò)增的調(diào)控因子1,3-PDO氧化還原酶基因大小在1.2 kb左右，用限制性內(nèi)切酶Nco I/Xho I對重組質(zhì)粒pET-28a-dhaT進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。酶切驗(yàn)證圖如圖1所示。在電泳圖上形成2條比較明亮的條帶，一條在5000bp左右，為切去dhaT基因的pET-28a片段；另一條在1200bp多的為1,3-PDO氧化還原酶基因的片段，此電泳圖說明氧化還原酶的基因已經(jīng)插入到了pET-28a載體上。通過測序結(jié)果證實(shí)1,3-PDO氧化還原酶基因已插入pET-28a中。

圖1　重組質(zhì)粒pET-28a-dhaT雙酶切電泳圖

將重組菌E. coli BL21（pET-28-dhaT）表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果見圖2。以含有pET-28a的大腸桿菌為空白對照，從電泳圖譜上可以看出，含有重組質(zhì)粒pET-28a-dhaT的大腸桿菌在相對分子質(zhì)量4.19×104處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白相對分子質(zhì)量大小一致，由此可知1,3-PDO氧化還原酶基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。重組蛋白用鎳親和試劑盒純化得到了單一的條帶，SDS-PAGE結(jié)果顯示已經(jīng)達(dá)到電泳純。

圖2　丁酸梭桿菌1,3-丙二醇氧化還原酶DhaT重組表達(dá)電泳圖

2.2重組1,3-PDO氧化還原酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1pH、溫度對酶活的影響

對重組1,3-PDO氧化還原酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究（圖3）。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，從40～50℃該酶活性隨著溫度的升高而快速增加，50℃時(shí)達(dá)到最高，隨后隨溫度升高，活性逐步下降。在40℃保溫2h，酶活還有50%。該酶的最適反應(yīng)pH值為10.0，在pH9.0～10.0范圍內(nèi)保持較高的活性；在pH 8.5～10.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在這范圍的pH緩沖液中冰上放置12h還能保持原酶活的60%以上。

圖3　1,3-丙二醇氧化還原酶DhaT金屬離子穩(wěn)定性

2.2.2金屬離子對酶活的影響

向反應(yīng)體系中添加終濃度為1mmol/L的各種金屬離子或EDTA測定酶活，以不加金屬離子的酶液在pH 值10.0，50℃下的測得的酶活為相對100%。結(jié)果如表1 所示， Ni+，Co2+，Cu2+和Fe3+對該酶有激活作用，其激活作用分別為147%，156%，123% 和176%。而EDTA能抑制該酶的活性，這說明該酶需要金屬離子的參與。Ca2+，Mn2+，K+和Li+對該酶有很明顯的抑制作用。

表1 金屬離子對重組1,3-PDO氧化還原酶的影響

2.2.3動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax的測定

在不同的1,3丙二醇濃度下測定重組的酶活，采用雙倒數(shù)法計(jì)算該酶的米氏常數(shù)。1/v表示酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)，1/s表示底物濃度的倒數(shù)，該直線在x軸上的截距為1/Km的值，在y軸上截距為最大反應(yīng)速度的倒數(shù)，再除以酶濃度（2.2mg/mL），即為Vmax。該酶以1,3-丙二醇為底物，在生理?xiàng)l件下的Vmax和Km分別為29.2 U/mg 和19.8 mmol/L（圖4）。

圖4　動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax的測定

2.3Clostridium butyricum VPI 3266來源的甘油脫水酶的克隆

根據(jù)同源性設(shè)計(jì)引物，以Clostridium butyricum VPI 3266基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到甘油脫水酶基因dhaB的全序列。電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的PCR基因片段大小在3.3 kb左右，用限制性內(nèi)切酶Nco I/Xho I將重組質(zhì)粒在37℃進(jìn)行1h的雙酶切實(shí)驗(yàn)。酶切驗(yàn)證圖如圖5所示。在電泳圖上形成2條比較明亮的條帶，一條在5000bp左右，為切去dhaB基因的pET-28a片段；另一條在3300bp的為dhaB基因片段，并通過測序結(jié)果證實(shí)甘油脫水酶基因已插入pET-28a。

圖5　重組質(zhì)粒pET-28a-dhaB雙酶切電泳圖

對丁酸梭桿菌VPI3266的dhaB基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因全長3315bp，編碼兩個(gè)蛋白，分別為甘油脫水酶的核心酶DhaB1和脫水酶的激活因子DhaB2。前者全長2367bp，編碼788個(gè)氨基酸，屬于gly-Radical家族；后者全長918bp，編碼305個(gè)氨基酸，屬于Radical-SAM家族。

2.4重組甘油脫水酶的表達(dá)

重組菌E. coli BL21（pET-28a-dhaB）進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色后的結(jié)果見圖6。以含有pET-28a空載質(zhì)粒的大腸桿菌為空白對照，可以看出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌在相對分子質(zhì)量80×103處和35×103附近處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白相對分子量大小一致，由此可知甘油脫水酶在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。

圖6　丁酸梭桿菌甘油脫水酶DhaB重組表達(dá)全細(xì)胞電泳圖

對重組菌破碎細(xì)胞后，立即對粗酶液進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)粗酶液能催化1,3-PDO生成醛類物質(zhì)。因此可以初步證實(shí)重組甘油脫水酶在大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。但由于該酶在有氧條件下非常容易失活，在緩沖中添加還原劑也無法使其活性保持足夠的時(shí)間進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)測定。另一方面，作者通過在E. coli中共表達(dá)Clostridium butyricum VPI 3266的甘油脫水酶和1,3-PDO氧化還原酶基因（結(jié)果未發(fā)表），最終使重組大腸桿菌能發(fā)酵產(chǎn)生1,3-PDO，從而進(jìn)一步證實(shí)重組甘油脫水酶在大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。

在測定Clostridium butyricum VPI 3266的甘油脫水酶的酶活過程中，添加維生素B12對酶活無任何影響，從而進(jìn)一步證明該甘油脫水酶非維生素B12依賴型。而目前研究較多的克雷伯氏桿菌和弗氏檸檬桿菌的甘油脫水酶是維生素B12依賴型，需要在發(fā)酵過程中添加維生素B12，從而增加生產(chǎn)成本[6-7]。而利用Clostridium butyricum VPI 3266的甘油脫水酶生產(chǎn)1,3-PDO可有效降低成本。

3　結(jié)　論

對丁酸梭桿菌VPI 3266的1,3-丙二醇代謝途徑關(guān)鍵酶甘油脫水酶（DhaB）與1，3丙二醇氧化還原酶（DhaT）進(jìn)行了克隆、表達(dá)研究。甘油脫水酶基因dhaB全長3315bp，編碼兩個(gè)蛋白亞基，分別為甘油脫水酶的核心酶和脫水酶的再激活酶。前者全長2367bp，編碼788個(gè)氨基酸，后者全長918bp，編碼305個(gè)氨基酸。DhaT的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值為10.0，在pH=8.5～10.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在45℃保溫2h，酶活還殘存50%。該酶以1,3-丙二醇為底物，在生理?xiàng)l件下的Vmax和Km分別為29.2U/mg 和19.8mmol/L。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)青年基金（30900008），江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131423）和江蘇省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）。

收稿日期：2015-05-04；修改稿日期：2015-05-15。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.01.028

中圖分類號：Q 814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）01–0210–06