miRNA對糖尿病性視網膜病變新生血管因子的調控作用研究進展

巫靈鮮 蔣玲 張家會

彭州市人民醫院眼耳鼻喉科 四川省彭州市 611930

miRNA對糖尿病性視網膜病變新生血管因子的調控作用研究進展

巫靈鮮 蔣玲 張家會

彭州市人民醫院眼耳鼻喉科 四川省彭州市 611930

糖尿病性視網膜病變是致盲的重要原因，新生血管因子在其發病機制中發揮著重要作用，對新生血管因子的作用進行調控，有可能成為治療DR的靶點。微小RNA(miRNAs)是一類高度保守、非編碼的小分子RNA，通過與靶基因轉錄的mRNA互補配對在轉錄后水平調節靶基因的表達。近年發現miRNAs與眼內新生血管的發生發展密切相關。本文就miRNAs的功能以及未來作為治療的可能手段的前景作為綜述。

微小RNA；糖尿病性視網膜病變；新生血管因子

糖尿病性視網膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最常見和最嚴重的微血管并發癥之一，其主要的特征是視網膜微血管功能障礙，最嚴重的后果是導致失明，它已成為大多數發達國家工作年齡人群致盲的首要原因。研究發現，糖尿病患者比非糖尿病患者發生視力損害的危險性高 25倍, 每年僅在美國就有1,2000－2,4000例患者因DR而失明。DR的發病率隨著糖尿病發病率及病程的增加而增加。據估計，美國40歲以上的成年人高達40%的人群患有某種類型的糖尿病，其中8%的患者因DR引起視覺損害。由于DR的發病機制錯綜復雜，其確切有效的治療方法也沒有最終明確。學者們普遍認為早期有效控制血糖、血壓和血脂是治療DR的關鍵措施；而激光光凝術是手術治療DR、預防新生血管形成的有效措施，但這一治療措施終究是一種破壞性的治療手段，而且并不能完全有效控制DR造成的視力損害。最近有研究表明miRNAs在血管性疾病、炎癥和新生血管形成等方面也發揮著重要作用。miRNAs可以調節血管內皮細胞的功能，對其分化、增殖和新生血管形成產生一定的影響，有望成為治療DR的新靶點。

1. miRNAs概述

microRNAs(miRNAs)是一類內源性的非編碼小RNAs，最初發現的內源性miRNAs是lin-4和lin-7，它參與基因表達后轉錄調節，通過與靶向mRNAs的3' -UTRs（3'端非編碼區）或編碼區結合，通過在翻譯水平抑制基因表達或在轉錄后水平降解mRNA的方式參與基因調控與蛋白表達。miRNAs的主要功能是調節生物體內與機體生長、發育、疾病發生過程有關的基因的表達。此外miRNAs可以作為觸發RNA干擾（RNA interference, RNAi）的分子參與細胞增殖、死亡、凋亡和脂肪代謝。另外，miRNAs還可能與轉座的抑制、基因重組有關，可能參與轉錄和轉錄后水平的基因表達調控，因此認為miRNAs可能與高等真核生物中調節基因表達的轉錄因子一樣重要。許多人類 miRNAs已經確定具有進化保守性，并且miRNAs靶向作用于人類三分之一的基因，隨著對miRNAs的深入研究，有利于對生長發育調控機理和治病機理的理解。

2. DR發病機制

DR早期的病理改變有毛細血管內皮細胞的基底膜增厚，周細胞喪失，毛細血管自動調節功能失代償，隨后出現內皮細胞屏障功能損害，血液成分滲出，毛細血管閉塞，導致廣泛的視網膜缺血，引起視網膜水腫。早期的病變進一步發展將導致視網膜廣泛缺血缺氧，使視網膜中刺激血管生成的因子和抑制血管生成的因子分泌失衡，引起視網膜新生血管形成，從而發展成為晚期的增殖性糖尿病性視網膜病變(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR)。新生血管形成是造成PDR患者視力損害和玻璃體積血、視網膜脫落、新生血管性青光眼等眼部并發癥的主要原因。關于DR的發病機制仍不清楚，學者們認為除了蛋白質非酶糖基化終末產物的堆積、蛋白激酶C激活、氧化應激學說、細胞因子的作用、腎素-血管緊張素及內皮系統的異常等對 DR的發生發展發揮著重要作用以外，糖尿病病程及其血糖控制情況亦是視網膜病變發生、發展的重要原因之一。然而，許多臨床觀察顯示：有些患者即使代謝控制良好也不能完全預防其發生，有些患者長期處于高血糖狀態卻不發生視網膜病變；有些患者在糖尿病早期就出現視網膜病變，而有些患者糖尿病病程長達數十年卻不發生視網膜病變，這就表明遺傳因素在DR的發生、發展中起了關鍵性作用。因此，對DR的易感基因進行干擾，有可能為DR的治療提供一種新的思路。

3.miRNAs對新生血管因子的調控作用

3.1 miRNAs對VEGF/VEGFR基因的表達調控

VEGF是一種有效的血管生成因子，通過與其特異性的受體VEGFR結合而發揮作用，可刺激血管內皮細胞分化、移行、增殖和管腔形成，對視網膜色素上皮細胞也有促增殖作用，并可增加血管滲透性。VEGF廣泛分布于人和動物體內的腦、腎、肝、眼等多種組織。正常情況下，視網膜周細胞、內皮細胞和視網膜色素上皮細胞內存在較低水平的VEGF，這對維持眼部血管的完整性是必要的，然而VEGF的過度表達將促進血管的增殖。臨床及動物實驗均已證實，在DR個體眼內特別是視網膜局部存在高水平的VEGF，隨著DR病程的延長，其表達量有逐漸增加的趨勢，其表達范圍也明顯擴大。VEGF是促進DR新生血管形成的重要因子之一，其作為血管內皮細胞特異的促有絲分裂素與表面相應受體結合，激活細胞內的一系列信號轉導途徑，造成內皮細胞增殖、遷移，最終形成新生血管。此外，VEGF/VEGFR基因亦是DR的易感基因，用于編碼VEGF、VEGFR，如對該易感基因進行調節將有助于為DR的防治提供新的策略。

近年來，學者們對miRNAs調節VEGF/VEGFR基因的功能已經進行了初步研究。低氧是誘導新生血管形成的重要刺激因素之一。在低氧狀態下，血管生成因子如VEGF等表達增加，從而誘導血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成。Hua等發現在低氧狀態下，多種miRNAs都可以直接調控VEGF的表達，它們通過協同和競爭的方式共同作用于 VEGF基因。隨后，Fish等發現miR-126可以調節VEGF對內皮細胞的作用。內皮細胞在維持血管完整性、新生血管形成和創傷修復方面發揮著重要作用。Wang等發現敲除大鼠miR-126基因后，由于血管完整性受損和內皮細胞增殖、遷移、新生血管形成等功能障礙，從而引起血管通透性增加，出血，甚至造成一部分胚胎死亡。miR-126先天缺失所導致的血管的病理改變和抑制血管生成因子如：VEGF和成纖維細胞生長因子等所導致的病理改變是一樣的，由此可見 miR-126可以通過抑制細胞內的 Spred-1（細胞內一種新生血管信號抑制劑）的表達加強 VEGF和 FGF的作用，從而促進血管形成。miR-126基因缺失或功能障礙可能導致一系列的病理性血管形成和功能障礙，這一研究結果有助于為各種異常新生血管形成和血管滲漏導致的疾病提供一種新的治療方法。此外，Shilo等應用抑制人微血管內皮細胞中Dicer酶的方法阻斷miRNAs的成熟過程，從而觀察miRNAs對人微血管內皮細胞氧化還原反應的調節作用。結果顯示，阻斷miRNAs的成熟后，可以降低人微血管內皮細胞在氧化應激狀態下產生的活性產物,如VEGF、腫瘤壞死因子-α等。他們認為其主要的作用機制是 miRNAs可以對轉錄因子HBP1產生負調控，而HBP1是p47phox的一種抑制性轉錄因子，抑制HBP的表達，將導致p47phox的表達增加，從而使人微血管內皮細胞在氧化應激狀態下產生的活性因子的表達增加，進一步誘導人微血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。該試驗證明了miRNAs可以調節人微血管內皮細胞內的氧化應激信號傳導通路，而還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶復合物的調節基因p47phox是miRNAs調節內皮細胞增殖、遷移和新生血管形成等過程的一個特定靶點。以上研究表明了miRNAs在缺氧狀態下對VEGF的表達具有重要的調控作用。

3.2 miRNAs對TGF-β基因的表達調控

TGF-β因具有使正常小鼠成纖維細胞表型發生轉化的能力而得名，是由淋巴細胞、血小板、單核細胞和肝枯否氏細胞等多種細胞分泌的一類具有多重生物學效應的因子，廣泛存在于動物正常組織細胞和轉化細胞中，對細胞的作用因細胞的種類，細胞周圍環境和細胞自身狀態不同而表現出刺激或抑制效應。TGF-β眼內來源廣泛，已知眼前、后段組織中角膜、虹膜、晶狀體上皮細胞、小梁網細胞、睫狀體上皮細胞和視網膜色素上皮細胞都能合成和分泌。TGF-β可由壓力負荷、高血糖、血管緊張素Ⅱ等多種因素刺激產生。DR患者血清中TGF-β含量明顯高于健康人群，并隨病程延長及眼部病情加重而增高。其參與DR發病機制可能為：（1）促進內皮細胞增殖、粘附、細胞外基質沉積；（2）激活絲裂原活化蛋白激酶，誘導人視網膜色素上皮細胞表達VEGF增加，促進DR新生血管形成；（3）增加纖維連接蛋白的合成，導致血管纖維化。此外，在新生血管的形成過程中，TGF-β參與新生血管的激活、重塑，并擴張存在的血管網，它能抑制內皮細胞的增殖，促進間質細胞向血管聚集，并向周細胞和平滑肌細胞分化，抑制內皮細胞(Edothelial cells, ECs)增殖。它同ang2、Tie2一起，在新生血管的重塑和維持血管的穩定中發揮作用。

目前有研究表明miRNAs對TGF-β信號通路具有一定的調控作用，同時TGF-β也可影響miRNAs的表達。首先Sun等研究表明 TGF-β可以通過調節 miR-24促進骨骼肌細胞分化，他們發現在骨骼肌細胞分化的過程中 miR-24的表達上調，同時TGF-β可以抑制miR-24的表達，TGF-β是通過抑制smad3和miR-24啟動子區域smad的結合位點而發揮作用的。隨后，Zavadil等研究發現TGF-β可以通過直接調控miRNAs的表達而影響上皮細胞的功能。有關糖尿病時miRNAs的調節作用研究尚少，最近 Kato等研究報道在糖尿病腎病時 miRNA-192可以通過抑制E-box受體從而調控TGF-β誘導的膠原表達。miRNAs在糖尿病腎病時對 TGF-β調控機制目前還不清楚，但是初步的研究表明miRNAs在糖尿病腎病的發生發展過程中發揮著重要的調控作用。DR和糖尿病腎病一樣都是糖尿病重要的微血管并發癥，他們之間存在著很多相似之處，因此，因此，有學者推測miRNAs在DR時也對TGF-β的表達發揮著一定的調控作用或通過某種機制影響TGF-β的生物學功能。

3.3 miRNAs對Ang-2/Tie-2信號傳導系統的調控

血管生成素（angiopoietin,Ang）是血管調節因子，分為Ang-1和Ang-2兩種。Ang1可增強血管內皮細胞和周細胞的連接，穩定血管構造。Ang-2是Ang-1的拮抗體，使周細胞游離，引起血管構造不穩定，在VEGF存在時促進血管新生。Ang-1和Ang-2均是通過和其受體Tie-2結合而發揮作用的。目前，有許多研究結果表明，Ang/Tie-2系統很可能在視網膜新生血管發生和形成中發揮重要作用。Hackett等報道無論是在胚胎視網膜發育階段或是成人視網膜病理性新生血管形成階段，視網膜表面和內核層Ang-2表達都增高，提示Ang-2能輔助VEGF促進視網膜新生血管形成。Umeda等研究也顯示：早產兒視網膜病變的視網膜纖維血管膜中有Ang-2,Tie-2的mRNA表達升高。轉基因Ang-2缺陷鼠，不可能誘導視網膜新生血管形成。此外，Takagi等,研究顯示：人視網膜血管增殖標本中，Ang-2，Tie-2表達均有升高；且在缺血性視網膜疾病所致的視網膜血管增殖膜中Ang-2、Tie-2表達明顯高于非缺血性視網膜疾病，同時Ozaki等收集了30例PDR病例和21例增生性玻璃體視網膜病變患者玻璃體液，經過檢測發現Ang水平均有所升高。

這些研究結果都提示Ang-2/Tie-2信號傳導系統的各個成員對視網膜微血管形成起到重要的促進作用，而DR是糖尿病常見的微血管并發癥，新生血管的形成是造成視力損害的重要因素，因此如何在DR的狀況下調整Ang/Tie-2信號系統各成員的表達及作用，使其在DR早期血管穩定、防滲漏中最大程度的發揮有益作用，是一個值得深入研究的問題。目前關于 miRNAs對Ang/Tie-2信號系統的調控作用機制研究尚少，僅有研究表明miRNAs可以調節人臍靜脈內皮細胞中Tie-2的表達，但是綜合以往研究多表明 miRNAs對新生血管形成的潛在調控作用及Ang/Tie-2信號系統在 DR新生血管形成中發揮的重要作用，miRNAs也有可能通過調節視網膜微血管內皮細胞中 Ang/Tie-2信號系統從而調控DR視網膜新生血管的形成。

4. 小結

大家知道血管新生在生理和病理的條件下均可以產生，但不同的是：生理條件下的血管生成是一個有序的過程，而病理條件下的血管生成表現為無序和不可控制。血管生成是一個復雜的過程，有多種生長因子、細胞黏附分子、轉錄因子等參與其中，如：VEGF/VEGFR、TGF-β、Ang/Tie、胰島素樣生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、基質金屬蛋白酶、缺氧誘導因子等。在正常的血管代謝中這些正向、負向作用因子保持平衡，在高糖作用下，平衡被打破，VEGF等正向因子被激活，刺激新生血管的形成。其主要步驟是：① 在VEGF等因子作用下，血管基底膜松弛，內皮細胞增殖；② 內皮細胞在黏附分子作用下，以出芽的方式向外遷徙；③ 各種促血管因子和其受體結合，促使內皮細胞形成管腔；④ 在各種血管生成因子的作用下，促進內皮細胞和周圍支持細胞相互作用，使血管壁緊密，完成血管的重塑。這個過程可以簡單的概括為：增殖、出芽、形成、重塑4個階段。在該過程中VEGF/VEGFR、Ang/Tie-2、TGF-β發揮著關鍵作用，而這些血管生成因子的主要作用靶細胞――內皮細胞的生物學行為和功能在新生血管的形成中也發揮著不可忽視的作用。因此，我們認為對作用于新生血管形成各個階段的關鍵性因子—VEGF/VEGFR、TGF-β、Ang/Tie-2信號系統和血管內皮細胞的生物學功能進行調控有可能成為抑制DR新生血管形成的一種新方法。目前有研究[32]表明使用小分子干擾 RNA選擇性抑制人臍靜脈內皮細胞中的DICER酶的表達，從而阻斷miRNAs的成熟過程，發現miRNAs的減少抑制了內皮細胞的增殖以及內皮條索的形成，并改變了多種影響內皮細胞生物學行為及血管生成能力的重要調節因子的表達情況，如 TEK/Tie-2、KDR/VEGFR等。因而隨著對miRNAs功能的深入了解，許多學者推測miRNAs在眼部目前治療糖尿病性視網膜病變新生血管形成的過程中有著不可估量的治療前景。尋找能靶向調控血管形成的miRNAs，并探討其內在調控途徑，對深入和全面理解血管形成的分子機制有著重要的意義,并使得 miRNAs有可能成為抑制糖尿病性視網膜病變治療的新靶點。

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R774.1

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1672-5018（2016）09-011-02