獸用狂犬病疫苗的發展

馬曉莉　徐錚　劉忠華　陳嘉　余文蘭　華南農業大學　510642

獸用狂犬病疫苗的發展

馬曉莉徐錚劉忠華陳嘉余文蘭華南農業大學510642

狂犬病病毒只有一種血清型，世界各地的狂犬病毒抗原性質是相同的。當前大部分國家所用的獸用狂犬病疫苗主要有三種，即弱毒苗、滅活疫苗和基因工程疫苗。當前我國獸用的有滅活苗和弱毒苗兩種，但是隨著生物和分子生物學技術的發展，新型狂犬病疫苗已經逐漸走進研究者的視野，例如多肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗及植物疫苗等。隨著獸用狂犬病疫苗的發展迅速，科學家們對其的研究也越來越深入，相信在不久的將來，狂犬病會得到很好的控制。

獸用；狂犬病疫苗；發展

1　神經組織疫苗

最早制造狂犬病疫苗的是法國的巴斯德。1882年他成功地應用連續傳代減弱病毒毒力的方法，用適應毒種來制造疫苗。早期的狂犬病疫苗是用成年山羊和綿羊神經組織經石炭酸或石炭酸和乙醚滅活后制成，用于犬的免疫。但免疫后不僅引起神經系統副反應，而且疫苗中殘余的活毒能夠引起狂犬病。1955年，Fuenja1ida和Pa1acios將狂犬病毒腦內接種3～5日齡的新生鼠，于接種后4天收集腦組織，制備了新生鼠腦疫苗。由于新生鼠腦神經組織中僅存在少量鞘磷脂，所以引發的副反應較少。在過去的40多年里，南美洲廣泛使用此疫苗。由于神經組織疫苗注射量大，接種次數多（14針以上），抗體產生慢、水平低，含有神經麻痹因子，易引發變態反應，而且疫苗中易殘留有感染性的活病毒，因此，WHO狂犬病專家委員會已提出盡快停止使用神經組織疫苗。

2　雞胚疫苗

用雞胚生產狂犬病疫苗的毒株主要是F1ury和Ke1ev株。F1ury株為1939年分離自死于狂犬病名叫F1ury的女孩，經1日齡雛雞腦內傳了138代減毒，隨后又經雞胚卵黃囊傳40～50代，取名F1ury雞胚株（F1ury LEP）。F1ury LEP對小白鼠、大白鼠和地鼠經腦內或肌肉途徑感染均有致病性，對豚鼠腦內感染有致病性，肌肉感染則無致病力。F1ury LEP對家兔腦內或肌肉均無致病性，對犬肌肉注射也沒有任何感染癥狀，但對貓和牛仍有致病性，因此認為LEP株對犬是安全的，被推薦僅供3月齡以上犬肌肉免疫用。LEP株進一步傳代至138代稱為LEP高代雞胚株（F1uryHEP），其毒力進一步減弱，但對乳鼠腦內接種仍有致病性，被推薦用于犬、貓和牛的肌肉免疫。Ke1ev株為1950年分離自以色列的一只患狂犬病的犬經雞胚傳100代減毒，對地鼠、豚鼠和家兔肌肉和腦內接種均未感染。用高濃度病毒懸液肌肉接種犬未產生任何感染癥狀，用于制備疫苗的毒種為60～70代雞胚株，已被推薦用于犬和牛的肌肉注射。

3　獸用弱毒口服疫苗

弱毒活疫苗是通過細胞培養生產，所用毒株主要包括 Street A1abama Dufferin（SAD）株、Eve1yn-Rokitnicki-Abe1seth（ERA）株及其他SAD株相關毒株。與滅活疫苗相比，弱毒活疫苗的生產成本低廉，主要是由于弱毒疫苗株RV能在動物體內增殖、合成病毒抗原，能以較少的病毒量誘導有效地保護性免疫反應，降低了狂犬病疫苗的生產成本，因而在亞洲、非洲和歐洲部分地區仍被使用。盡管弱毒活疫苗價格比滅活疫苗低廉，而且可以通過口服途徑免疫接種，然而弱毒活疫苗存在一個致命缺陷：病毒在動物體內增殖時，其殘留毒力或致病性突變有時會致使接種動物發病。世界衛生組織不推介弱毒活疫苗經非口服途徑免疫接種動物，現在主要用于動物的口服免疫。因此，現在滅活疫苗比弱毒活疫苗的使用范圍更為廣泛。

4　基因工程疫苗

隨著現代生物技術的發展和應用，人們開始研究狂犬病病毒重組活疫苗，目的在于保留狂犬病病毒有免疫原性的抗原部分，而不含狂犬病病毒的致病性，降低組織培養的生產成本。狂犬病病毒中可誘導中和抗體產生的抗原為糖蛋白（G），具有誘導細胞免疫的保護性抗原為核蛋白 （N）。近幾年對狂犬病病毒G和N基因表達及免疫效果進行了研究，主要為口服免疫有效的重組體。1984年美國 Wistar研究所和法國Trangen合作研究，由Kieny等合成了一種新疫苗，用牛痘病毒加入狂犬病毒的糖蛋白抗原基因，稱為VRG （Vaccinia Rabies G1ycoprotein）。VRG的主要步驟是先克隆G基因的cDNA，經修飾后拼接啟動子及痘病毒的TK基因構成載體，再與感染痘病毒的細胞進行重組。再經空斑克隆3次純化后，經Southemb1ot、免疫熒光、免疫印染等證實表達的糖蛋白分子量為66kD，與天然糖蛋白相同。可在Vero細胞系上培養。VRG口服疫苗于1987年10月24日在比利時進行投放，共投放了250個誘餌。對實驗中心地區238個誘餌進行觀察，在投放后94%的誘餌被吃掉。溫度在-10～20℃的條件下，VRG保存 90天沒有明顯的滴度變化，只有在4個月時發生下降。由此可見VRG株VI服疫苗具備有效性、無毒性和熱穩定性的特點。1989年加拿大Prevec等將狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因cDNA重組到人腺病毒5型基因組中，獲得重組體HAd5RG，臭鼬口服HAd5RG后，保護率100%基因重組口服疫苗比現行活疫苗更安全、更便于生產，而且成本低，使用方便。

國內有研究在狂犬病毒弱毒株Hep-F1ury株全基因組3'-N-P-M-G-L-5'的偽基因區域（G與L之間），插入一個G基因，構建了攜帶雙G基因的全長感染性克隆，其與輔助質粒共轉染BHK-21細胞，成功獲得狂犬病毒Hep-F1ury-dG嵌合病毒，盲傳十代，用熒光抗體和RT-PCR鑒定，該嵌合病毒在BHK-21細胞中穩定生長。對其進行生物學特性研究，結果表明，Hep-F1ury-dG株和rHep-F1ury株比較，其致病性降低、免疫原性提高。國內研究者在廣州市增城區某村進行狂犬病基因工程滅活疫苗（Hep-F1ury-dG株）環境釋放試驗，登記該村所有家養犬的信息并存檔，同時進行疫苗免疫。隨機采集免疫前血清樣品66份，免疫后21天獲得血清樣品66份，使用ELISA方法檢測樣品的抗體水平。發現免疫前該村犬只抗體陽轉率為26%，免疫后21天抗體陽轉率達到83%。統計分析表明，免疫前后抗體水平差異具有統計學意義。由此得出結論，狂犬病基因工程滅活疫苗（Hep-F1ury-dG株）免疫犬只后可提供足夠的保護力，有效保護犬只免受狂犬病病毒感染，因而預防狂犬病從犬-犬或犬-人的傳播。為農村地區家養犬建立免疫檔案，監控犬只抗體水平，使犬群間形成狂犬病抗體陽性率達到70%以上的堅強免疫帶，是預防農村地區狂犬病發生的一種可行、有效的方法。

（1）基因重組減毒疫苗。20世紀80年代，狂犬病病毒糖蛋白基因克隆和測序不久后，便開始制備異源性重組狂犬病疫苗研究。狂犬病毒重組疫苗是指應用DNA重組技術，借助載體對狂犬病毒中的基因進行重組表達，表達產物或重組體本身用于研制疫苗。由于重組體只保留了狂犬病毒中具有免疫作用的基因，因此這種疫苗不具有發生狂犬病的潛在危險。重組疫苗的載體有大腸桿菌、痘苗病毒腺病毒、桿狀病毒、犬皰疹病毒和非復制病毒載體等。有學者就曾通過基因敲除使RV的磷酸化蛋白基因缺失，構建重組RV活疫苗。這種疫苗與傳統的減毒活苗相比，也可以誘導機體產生長時間的保護性抗體。但是基因重組減毒疫苗也存在著潛在的危險，比如基因突變的減毒活疫苗會與自然存在的野毒株發生重組，或者原本敲除的基因會重新發生基因修補，從而出現毒力增強的現象。

（2）核酸疫苗。也叫DNA疫苗，是將編碼某種抗原蛋白的基因置于真核表達元件的控制之下，構成重組質粒DNA，將其直接導入動物機體內，通過宿主細胞的轉錄翻譯系統合成抗原蛋白，從而誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答。基因疫苗能誘導產生細胞和體液免疫，能夠刺激產生較強和較持久的免疫應答，可以將含有不同抗原基因的質粒混合起來進行聯合免疫，能夠反復使用，因此基因疫苗成為新型疫苗發展的熱點。第一個報道的狂犬病核酸疫苗是攜帶和表達ERA株糖蛋白eDNA的重組質粒。1994年Wistar研究所Xiang ZQ等將編碼狂犬病病毒糖蛋白的eDNA插入SV40啟動子下游，構建狂犬病病毒的DNA疫苗，直接注射小鼠腓腸肌，免疫3次，間隔2～3周，150g/次。免疫后小鼠產生了抗狂犬病病毒中和抗體、抗狂犬病病毒糖蛋白特異性CTL和分泌淋巴因子的rrh細胞，用5倍LD50劑量的狂犬病病毒CVS株攻擊，均獲得保護，而對照組小鼠14天內全部死亡。Lodme11 D L等把帶有G基因的DNA包被在2.6in金粒上，用基因槍免疫小鼠，初免及加強免疫后均可檢測高滴度的抗體，并持續300天，315天后用致死量的狂犬病病毒攻擊，小鼠全部存活。Ray N B等用單磷脂質A作為免疫刺激物，皮下免疫小鼠，可以提高DNA疫苗的免疫應答。國內扈榮良等首先將狂犬病病毒糖蛋白G基因插入PMTOIO/A+表達載體中，肌肉免疫小鼠后，能產生抗狂犬病病毒的抗體，對狂犬病病毒強毒攻擊有一定的保護作用。李萍等將狂犬病病毒G基因重組到質粒PRC/CMV中，免疫小鼠可產生低滴度的中和抗體，對狂犬病病毒強毒攻擊有一定的保護作用。基因疫苗雖然有眾多優勢，但是基因疫苗可能存在的安全性問題是外源基因導入體內后，可能與細胞染色體基因組發生整合，從而導致細胞轉化和癌變，但迄今尚未發現有整合的證據。

捕殺流浪犬，加強家犬管理和強制接種狂犬病疫苗，預防家畜及野生動物的狂犬病是預防人感染狂犬病的重要措施，其任務涉及面廣，需要全社會的配合、支持與理解。

［1］王健青，謝海燕，朱燕秋，東莞幾種重要人畜共患病的調查分析［J］.黑龍江畜牧獸醫，2014，02：67-68.

［2］張德禮，狂犬病疫苗的研究動向［J］.中國畜禽傳染病，1994，6： 52-55.