人肺腺癌細胞系中腫瘤干細胞的分離培養及鑒定*

楊佳　方志紅　吳建春　徐靜　殷曉聆　趙凡塵　李雁

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人肺腺癌細胞系中腫瘤干細胞的分離培養及鑒定*

楊佳方志紅吳建春徐靜殷曉聆趙凡塵李雁

摘要目的：從人肺腺癌細胞系A549及H1299中分離富集含腫瘤干細胞的細胞球并鑒定其生物學特性。方法：用無血清懸浮培養的方法從人肺腺癌A549及H1299細胞株中富集得到腫瘤細胞球。將腫瘤細胞球傳代擴增，體外利用CCK-8法、平皿克隆以及Transwell小室實驗，研究細胞球的增殖情況、自我更新和侵襲轉移能力；通過RT-PCR檢測干細胞特異性轉錄因子Oct4、Nanog基因表達情況；體內利用裸鼠移植瘤形成實驗研究肺癌細胞球的成瘤能力。鑒定細胞球的腫瘤干細胞特性。結果：在無血清懸浮培養下，A549及H1299細胞株3～6天后能形成穩定傳代的腫瘤懸浮球，懸浮球的體外自我更新、克隆形成和侵襲轉移等能力均高于其親本細胞（P<0.05）；干細胞核心基因Oct4和Nanog的mRNA表達水平明顯升高（P<0.05）；A549懸浮球可以明顯提高裸鼠體內成瘤能力。結論：通過無血清懸浮培養法可有效富集A549及H1299細胞系中的干細胞成分，該法可成為快速易行構建肺腺癌干細胞模型的方法。

關鍵詞肺腺癌腫瘤干細胞無血清培養分離鑒定

作者單位：上海中醫藥大學附屬上海市中醫醫院腫瘤科（上海市201203）

*本文課題受國家自然基金面上項目（編號：81473627）和上海市衛生局科研項目（編號：20124078）資助

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中肺腺癌的比例占40%以上，盡管近些年在肺癌防治和分子靶向研究方面有了較大突破，但肺癌患者的5年生存率仍未超過17%［1］。腫瘤干細胞學說在越來越多的腫瘤中被證實和認可，該理論認為肺癌干細胞是導致肺癌快速進展、耐藥和復發轉移的根源，其為肺癌組織中一群數量極少但具有高致瘤性、自我更新、分化潛能和耐藥性的細胞［2］。因此，研究肺癌干細胞將對肺癌的治療產生重要意義，其第一步就是分離和富集肺癌干細胞。目前，肺癌干細胞的構建方法主要有通過特定標記物（流式或免疫磁珠）分選或功能學（SP、EMT、無血清懸浮）分選［3］等，尚無公認的針對肺癌干細胞的特異性干細胞標記物［4］。

本研究采用無血清非黏附培養法對肺腺癌細胞系A549及H1299進行分離和富集，并對富集的懸浮球進行一系列體、內外腫瘤干細胞相關實驗鑒定；旨在建立一種適用于體外快速構建肺腺癌干細胞的通用方法，為肺癌干細胞的深入研究提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及動物人肺腺癌細胞株A549和H1299購自上海生命科學院細胞庫（ATCC）。4～5周齡雄性BALB/c裸鼠購自中科院上海生命科學研究院斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號［SCXK（滬）2012-0002］，體質量18～22 g，雄性，于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室飼養。

1.1.2主要試劑RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養基均購自美國Gibco公司，0.25%胰酶-EDTA（美國HyClone公司），重組人表皮生長因子（EGF）、重組人堿性成纖維生長因子（bF?GF）均購自美國PeproTech公司，B27（美國Invitrogen公司），重組人胰島素購自美國Sigma公司；鼠抗人Oct4和Nanog單克隆抗體（美國Abcam公司），PVDF膜（美國Millipore公司），兔抗人GAPDH單克隆抗體（美國CST公司）；鼠抗兔IgG（美國CST公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMSO（美國Sigma公司）；Transwell小室（美國BD公司），Matrigel膠（美國BD公司），低黏附培養板（美國Corning公司）；逆轉錄試劑盒及RTPCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養實驗分為A549及H1299貼壁細胞組和A549及H1299懸浮球組。A549及H1299貼壁細胞培養，在37℃、5%CO2培養箱內培養，培養基為含10%FBS的RPMI 1640，實驗取對數生長期的細胞。

1.2.2懸浮球培養采用0.25%胰酶將對數生長期的A549和H1299細胞消化制成單細胞懸液，100 rpm/min離心5 min后棄上清，將細胞按3×104個/孔的密度，平鋪到超低黏附6孔板中；每孔加無血清培養液3～4 mL，無血清培養液DMEM/F12中含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、20 μL/mL B27，重組人胰島素4 μg/mL。每隔2～3 d半量換液，每隔4～6 d傳代，顯微鏡下分別觀察A549及H1299細胞的成球情況，實驗用第3代以后的懸浮球。

1.2.3CCK-8增殖實驗分別將兩種貼壁細胞和懸浮球胰酶消化后制成單細胞懸液，以細胞2×103個/孔的密度加入96孔板中，用完全培養基（RPMI 1640加10%FBS）培養，以單一培養液組作為空白組，在37℃、5%CO2條件下培養。于接種后連續6天，每隔24 h測細胞數。加入10 μL/孔CCK-8，上酶標儀檢測光密度值。縱坐標為A490平均數，橫坐標為天數，繪制細胞生長曲線。

1.2.4平皿克隆形成實驗將A549、H1299貼壁細胞及其懸浮球胰酶消化后制成單細胞懸液，按細胞200個/孔的密度分散鋪于普通6孔板中，每組3個復孔，每孔加入2 mL含血清的RPMI 1640培養基，2～3 d換液。在培養箱內培養10 d，棄培養液，加入4%多聚甲醛固定10 min后，用1%的結晶紫染色。觀察形成的克隆數目，其中以>50個細胞的克隆為陽性克隆。1.2.5 Transwell侵襲小室實驗將Matrigel膠和無血清培養液按1:5比例混勻成80 μL，平鋪于小室底部，避免氣泡產生，置于37℃培養中孵育4～5 h；取對數生長期的A549、H1299貼壁親本細胞和A549、H1299懸浮球細胞制備單細胞懸液并計數，按每孔1×105/ 100 μL接種于Transwell小室上層，用無血清的DMEM/F12培養，下室用含15%胎牛血清的RMPI 1640培養基，放入培養箱中24 h后取出。用棉棒輕輕擦去小室上層細胞，染色固定漂洗后，于顯微鏡下隨機取中央區的5個視野，計算浸潤細胞數［5］，統計結果。實驗重復3次。

1.2.6RT-PCR檢測收集A549、H1299貼壁細胞及其懸浮球，用Trizol法提取總RNA，按照Takara逆轉錄及RT-PCR試劑盒說明書操作，用2-ΔΔCT法對檢測結果進行分析。實驗重復3次。引物由上海生工生物工程有限公司合成。實驗所需引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7裸鼠成瘤實驗4～5周齡雄性BALB/c裸鼠（購自中科院上海生命科學研究院斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號［SCXK（滬）2012-0002］，測定質量后隨機分組，每組5只，將收集好的A549、H1299貼壁細胞和A549 sphere、H1299 sphere細胞懸液按照每只1×106個/200 μL（重懸于無血清DMEM/ F12培養液中）分別注射于裸鼠背部皮下的左、右兩側，左側接種貼壁細胞，右側接種懸浮球細胞。注射后3 d起觀察移植瘤形成情況，每3天測量一次腫瘤體積［V=a×b2/2（a為長徑，b為短徑）］，連續4周。28 d后處死裸鼠，剝取腫瘤稱重、測量瘤體積，并繪制移植瘤生長曲線。

1.3統計學處理

實驗采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，兩組樣本比較采用獨立樣本t檢驗，數據均以±s表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1細胞懸浮球培養

A549及H1299細胞株在含10%FBS的培養液中呈梭形貼壁生長（圖1A、B），而在含各種刺激因子的無血清培養液中細胞1～3 d后懸浮分散于低黏附培養板中，形成若干大小、形態不等的懸浮球，其余散在細胞逐漸凋亡（圖1C、D），6～8 d培養后，細胞呈球形或橢圓形立體生長，平均直徑增大，懸浮球數目增多，球內細胞結合緊密，球體飽滿，折光性強（圖1E、F）。表明在連續無血清培養基和無黏附板條件下能成功誘導A549及H1299細胞株形成具有自我更新能力的干細胞球。

2.2細胞增殖能力和克隆形成能力

用CCK-8法分別檢測A549、H1299及其懸浮球細胞隨天數增加的增殖情況，并繪制生長曲線。觀察發現A549及H1299懸浮球細胞大約從第4天開始進入對數生長期，第8天進入平臺期，而普通A549及H1299細胞直到第6天才開始進入對數生長期。表明無論在A549還是H1299細胞系中，懸浮球的增殖能力均明顯高于親代貼壁細胞（P<0.05，圖2A、B）。進一步通過平皿克隆實驗檢測懸浮球克隆形成能力，將A549、H1299及其懸浮球細胞以同等數目分別接種于普通6孔板，每組做3個復孔。經過10 d的培養，計數發現懸浮球形成的克隆數［A549懸浮球（87± 3）、H1299懸浮球（92±6）］顯著高于貼壁親代細胞［A549（17±5）、H1299（32±3），（P<0.05，圖2C、D）］。通過上述實驗說明，A549及H1299懸浮球均比其貼壁親代細胞具有更強的干細胞特性—自我更新能力；同時，發現由于細胞系之間的差異，在相同培養條件和天數下，H1299懸浮球細胞生長速度要比A549懸浮球更快，克隆形成的數目更多。

2.3細胞侵襲能力

A549細胞球穿過微孔膜的細胞數為（94±14）個/視野，多于A549貼壁細胞的（38±5）個/視野（t=6.71，P<0.01，圖3A、B）；H1299細胞球穿過微孔膜的細胞數為（117±19）個/視野，多于H1299貼壁細胞的（38± 5）個/視野（t=5.74，P<0.01，圖3C、D）。隨機取中央區的5個視野，實驗重復3次，做統計圖3E，顯示培養的懸浮球細胞比貼壁親代細胞具有更強的干細胞特性—侵襲轉移能力。

圖1　顯微鏡下觀察細胞及細胞球生長情況（×200）Figures 1　The cell growth under microscope (×200)

2.4干性相關基因表達的比較

通過qPCR檢測在A549、H1299貼壁細胞及其懸浮細胞球中的干性轉錄因子Nanog和Oct-4表達差異：A549貼壁細胞vs懸浮細胞球組中Nanog［（1.00± 0.34）vs（25.61±1.21），P<0.005］、Oct-4［（2.35±0.70）vs （7.22±0.37），P<0.05］；H1299貼壁細胞vs懸浮細胞球組中Nanog［（1.00±0.34）vs（27.32±0.54），P<0.005］、Oct-4［（1.59±0.67）vs（4.22±0.37），P<0.05］。提示在mRNA水平，懸浮球中干細胞核心調控基因Nanog和Oct4的表達明顯升高，而大量實驗已經證實，這兩個因子在多種腫瘤干細胞中均表達增高，提示所培養的懸浮球細胞具有干細胞特性（圖3F）。

2.5體內致瘤能力

能否在體內成功建立腫瘤移植瘤模型是檢驗CSC的一個“金標準”［4，6］。在BALB/c裸鼠背部皮下的左、右兩側分別接種1×106個細胞（正常A549細胞系裸鼠皮下成瘤，每只接種細胞數為4×106～8×106個細胞），左側接種貼壁細胞，右側接種懸浮球細胞。結果發現，在1×106個細胞的情況下，H1299細胞系無論是貼壁細胞還是懸浮球細胞，均難以形成瘤塊，可能與H1299細胞系本身有關。A549細胞系中的懸浮球細胞成瘤能力要明顯強于貼壁細胞組，成瘤潛伏期要短于貼壁細胞組，A549懸浮球細胞在第3～5天時，一組的5只裸鼠皮下均可見一明顯包塊，而貼壁細胞組直至第12天時，才均陸續長出肉眼可見瘤體；且瘤塊體積隨天數迅速增大，相對應的細胞球組瘤體重量也較后者要重（圖4）。說明A549細胞球在較少的細胞數下，具有更強的體內致瘤能力。

圖2　細胞增殖能力和克隆形成能力比較Figure 2　The ability of cell proliferation and colony formation

圖3　細胞侵襲能力和干性相關基因的檢測Figure 3　The detection of cell invasion and stem cell genes

圖4　體內成瘤能力分析Figure 4　Tumorigenic capacity analysis

3　討論

有關腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）理論一直存在各種爭議。自1997年，從白血病中分離提取出具有干細胞特性的細胞后，在越來越多的實體腫瘤中均分離并鑒定出腫瘤干細胞［7］，這個學術觀點逐漸被大家所接受。CSCs理論認為，腫瘤干細胞是腫瘤組織中一類數量極少但具有極強自我更新、增殖分化潛能的細胞，是腫瘤發生發展、復發轉移和耐藥的根源。腫瘤干細胞理論的提出，為人們解決腫瘤術后復發轉移，放、化療后的耐藥提供了新的視角，為深入研究腫瘤機制及靶向治療提供可能。

通過SP細胞或表面標記物篩選法［8］、分子克隆構建法［9］、EMT耐藥培養法［10］及無血清懸浮培養［6，11］等方法分離和富集肺癌中的干細胞成分，已成為主要方法。然而這些方法都有一定的自身適用性和局限性。側群細胞SP細胞在Hoechst 33342染色分離過程中，可因染料的毒性而干擾其成瘤能力；依靠特異性標記物流式分選出的陽性干細胞亞群數量少，后續培養壽命短暫，不利于長期實驗。且由于不同分型的細胞存在異質性，肺癌干細胞表面特異性標志物（CD133［12］、CD44［13］、ALDH［14］等）存在較大爭議，一部分研究認為CD133+肺癌細胞具有干細胞特性，CD133可作為肺癌干細胞的標志物；而另一部分研究則認為肺癌干細胞中CD133的表達并非陽性［15］，H446和A549細胞系中CD133-細胞也含腫瘤干細胞成分［16］。無血清懸浮球培養法最早應用于神經干細胞，目前已在眾多實體腫瘤（乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、肝癌等）［17-19］中均得以證實。肺癌中已分別有報道A549［16］、H460［6］等細胞通過懸浮培養液條件形成具有干細胞特性的細胞，但尚未在同一個肺腺癌細胞系上，用同樣的懸浮條件驗證2種以上的細胞系；這樣既可規避因其組織來源異質性而存在的差異，同時又能較清楚地闡明不同分型下的腺癌類型；懸浮球培養法原理利用只有CSCs相對未分化的細胞才能夠在SFM中懸浮生長并不斷增殖，而普通高分化的腫瘤細胞則因無法耐受這種無血清的生長環境出現凋亡［5］。此法雖然也存在著培養的腫瘤干細胞比例不純、容易隨著代數的增加而日益分化問題，但因其成本低，可方便快捷地分離富集CSC樣細胞而得到越來越多的應用。

本研究初步探討了利用無血清懸浮培養法從肺腺癌細胞A549及H1299中分離富集了可穩定傳代的細胞球，并對其干細胞特性進行了一系列驗證，并隨著培養時間的增加，細胞球平均直徑增大，懸浮球數目增多。通過體外CCK-8、平皿克隆和Transwell小室等實驗證明，無血清懸浮培養獲得的懸浮球比貼壁親代細胞具有明顯干細胞特性—強增殖性和侵襲轉移性。進一步檢測了懸浮球中Oct4和Nanog的表達，這兩個轉錄因子和Sox2、Klf4［20］構成了胚胎干細胞的核心調控因子，是維持胚胎干細胞自我更新和多潛能的關鍵開關。近年來被廣泛證實，在多種實體腫瘤干細胞中均呈現較高表達，Oct4和Nanog與肺癌干細胞關系尤為密切［21］，肺腺癌患者腫瘤組織中這兩個基因高表達者，預后均較差，易復發轉移。檢測發現懸浮球中這2個基因的表達均明顯高于貼壁親本細胞，差異具有統計學意義，其中Nanog差異尤為明顯，可增高25倍（P<0.001）。另一方面，通過體內動物成瘤實驗，將A549細胞球和A549細胞在同等較少的細胞數目下，接種于同一只裸鼠的左右兩邊，發現懸浮球組成瘤潛伏期、瘤體生長速度、瘤體積等成瘤能力指標均遠強于貼壁細胞組。而H1299細胞系，無論其親代細胞或是懸浮球細胞經過多次嘗試，均無法在裸鼠體內皮下成瘤，可能與細胞、鼠系差異有關。以上通過體內、體外的一系列實驗表明，無血清懸浮培養法可有效分離、富集到具有干細胞特性的肺癌細胞［11］。

本研究在肺癌的兩個細胞系通過同樣的構建方法加以嘗試，避免了因其組織來源異質性而存在的差異，雖然A549懸浮球的干細胞特性并非與H1299懸浮球完全一致，但和親代貼壁細胞相比，均表現了更強的干細胞特性。表明通過無血清懸浮培養法可以培養出具有干細胞特性的肺腺癌細胞株。作為一個快速易行的構建干細胞模型方法，為肺癌干細胞生物學特性的深入研究及靶向藥物篩選奠定了基礎。

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（2015-12-20收稿）

（2016-01-15修回）

（編輯：楊紅欣校對：鄭莉）

楊佳專業方向為腫瘤臨床與基礎研究。E-mail：jiajiayy07@163.com

·臨床研究與應用·

Isolation and identification of lung cancer stem like cells from human lung adenocarcinoma cell lines

Jia YANG, Zhihong FANG, Jianchun WU, Jing XU, Xiaolin YIN, Fanchen Zhao, Yan LI
Correspondence to: Yan LI; E-mail: 18916767226@163.com
Department of Oncology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Shanghai Chinese Medicine Hospital, Shanghai 201203, China
This work were supported by the Key Project of National Natural Science Foundation of China (No.81473627) and Project from Shanghai Municipal Health Bureau (No.20124078)

AbstractObjective: To isolate cell spheres containing cancer stem cells (CSCs) from lung cancer cell lines (A549 and H1299) and identify their biological characteristics. Methods: By adopting the method of serum-free suspension culture, A549 cells and H1299 cells were cultured on no-adhesion plate to form tumor spheres. Clone assay, CCK-8 assay, and Transwell assay were employed to observe proliferation, self-renewal and invasion of tumor spheres. Besides, RT-PCR was performed to compare the expression levels of stem cell markers between sphere cells and adherent cells. Adherent A549 cells and A549 cell spheres were inoculated subcutaneously in nude mice and the tumor growth was assessed. Results: Isolated CSCs from A549 cells and H1299 cells in serum-free medium (SFM) without adhesion could grow as floating cell spheres. The results demonstrated that the self-renewal, proliferation and invasion of A549 and H1299 sphere cells were stronger than parent cells (P<0.05). When compared with adherent cells, the mRNA level of expression of cell spheres' stem cell markers (Oct4 and Nanog) were significantly high (P<0.05) and A549 spheres had a stronger tumorigenicity in nude mice. Conclusion: SFM without adhesion can be a quick and easy method to construct stem cells model from human lung adenocarcinoma cell lines A549 and H1299.

Keywords:lung adenocarcinoma, cancer stem cell, serum-free culture, isolation, identification

作者簡介

通信作者：李雁18916767226@163.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.03.441