柴胡加龍骨牡蠣湯對創傷后應激障礙模型大鼠行為學的調節作用

陳光耀　吳卓耘　張新寧　陳瑩瑩　劉燕　丁雷　周清緣　宋月晗

100029　北京中醫藥大學基礎醫學院

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·論著·

柴胡加龍骨牡蠣湯對創傷后應激障礙模型大鼠行為學的調節作用

陳光耀吳卓耘張新寧陳瑩瑩劉燕丁雷周清緣宋月晗

100029北京中醫藥大學基礎醫學院

【摘要】目的觀察柴胡加龍骨牡蠣湯對單次延長應激(single-prolonged stress，SPS)建立的創傷后應激障礙(post traumatic stress disorder，PTSD)模型大鼠行為學的調節作用。 方法采用曠場實驗以及強迫游泳實驗，對不同組大鼠的行為學改變情況進行檢測。 結果(1)與正常組大鼠進行比較，模型組大鼠游泳試驗不動時間延長、次數增多，曠場實驗直立時間減少、運動總距離縮短(P<0.05)。(2)與模型組比較，柴胡桂枝龍骨牡蠣湯以及阿普唑侖均能夠降低大鼠游泳試驗不動次數、時間以及增加曠場實驗直立時間、運動總距離(P<0.05)，且兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)。結論本實驗成功復制了PTSD樣大鼠模型，柴胡加龍骨牡蠣湯能夠改善改變SPS建立的PTSD大鼠的情緒行為變化，能夠從總體方面改善PTSD樣大鼠的癥狀。

【關鍵詞】創傷后應激障礙；柴胡加龍骨牡蠣湯；單次延長應激；行為學實驗

創傷后應激障礙(post traumatic stress disorder，PTSD)是指由嚴重的突發性、威脅性或災難性生活事件導致長期持續存在的精神障礙[1]，其癥狀主要包括對創傷事件的病理性重現、對創傷相關線索的回避、持續性的高喚醒，以及對創傷經歷的選擇性遺忘和情感麻木[2]。由于PTSD在災難后普遍發生，發病率高、病程長、療效差，嚴重影響了患者的生活質量[3]。因此針對PTSD治療手段的增加以及相關藥物的研發成為當務之急。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第一百零七條，主治“胸滿煩驚，小便不利，譫語，一身盡重,不可轉側”。研究發現其對各種神志類疾病如失眠、更年期綜合征、自閉癥、抑郁癥、焦慮癥、癲癇等有著良好的效果[4]。一項以汶川地震幸存者中PTSD患者為研究對象、以柴胡加龍骨牡蠣湯為主方配制的藥物作為變量的隨機安慰劑對照試驗顯示出其對PTSD癥狀有著良好的改善作用[5]。

在涉及到藥物對神經系統的作用研究上，行為學試驗發揮著重要的作用，它能夠反映出實驗動物的整體狀態，因而較之其他指標具有更為重要的意義，是評價實驗成功與否的最重要的標準，能夠為進一步實驗提供相對合理的依據[6]。因而通過柴胡加龍骨牡蠣湯對單次延長應激(single-prolonged stress,SPS)建立的PTSD樣大鼠行為學的調節作用的研究，能夠為進一步的相關生理、生化實驗研究提供思路。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康成年雄性SD大鼠 48 只，體質量(180±20)g，提前一周購入并進行適應性飼養。實驗動物購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司；許可證號:SCXK(京)2011-0004。

1.2實驗藥品

柴胡加龍骨牡蠣湯(藥物組成：《傷寒論》所記載的柴胡加龍骨牡蠣湯去鉛丹，由柴胡、半夏、桂枝、茯苓、黃芩、大棗、人參、牡蠣、龍骨、生姜組成，各藥用量按照原方比例)由北京中醫藥大學東直門醫院提供并制備成顆粒劑，顆粒劑用蒸餾水配制成懸濁液，每毫升含生藥1 g；陽性對照組實驗藥物為阿普唑侖，用蒸餾水配置成0.01 mg/mL的溶液。藥物放在4℃冰箱中備用。

1.3儀器設備

大鼠固定器、木質曠場箱由北京中醫藥大學神經免疫實驗室提供。行為學自動觀察分析系統采用Nodule公司行為學研究設備，含計算機、攝像監控以及 observior、ethevision 分析軟件。

1.4實驗分組

將大鼠適應性喂養后，按體質量隨機分為 4組，分別為正常對照組、模型組、柴胡加龍骨牡蠣湯組、阿普唑侖組，每組12只。在造模束縛過程中共10只大鼠死亡，為保證實驗組大鼠數量，將正常對照組4只大鼠造模后分配進入實驗組，其中柴胡加龍骨牡蠣湯組在給藥第7天死亡一只。

1.5造模

采用SPS法建立 PTSD 大鼠模型，包括先將大鼠進行2小時束縛，隨后將大鼠置于水箱中進行20分鐘的強迫游泳，游泳結束15分鐘后將大鼠置于密閉容器中進行乙醚麻醉，待大鼠昏迷后放在通風處，待意識恢復后再放回鼠籠靜養。

1.6給藥

造模后每天早 7:00 對大鼠進行灌胃，正常對照組和模型組按體重給予1 mL/100 g生理鹽水；柴胡桂枝龍骨牡蠣湯組給予1 mL/100 g的柴胡加龍骨牡蠣湯懸濁液；阿普唑侖組給予1 mL/100 g的阿普唑侖溶液。連續灌胃14天后進行行為學檢測。

1.7實驗內容

1.7.1曠場試驗采用立方形灰色木質曠場箱，其底面為灰色，用黑線劃分為 25個正方形格(20 cm ×20 cm)，分為沿側壁的16個外周格，其余為中心9個中央格，攝像頭置于中央格正上方。實驗時將動物放入箱內底面中心，實驗人員遠離曠場箱，同時進行攝像5分鐘。每次實驗結束后用酒精清洗方箱內部，以免影響下次測試，最后采用計算機軟件對錄像進行分析。

1.7.2強迫游泳實驗曠場實驗結束后將大鼠放入有水的水箱中，測量大鼠5分鐘內放棄逃跑而保持靜止不動(僅前肢輕微運動以保持頭部露出水面)的時間作為指標。

1.8統計學分析

2結果

2.1對大鼠游泳試驗不動時間及次數影響

對大鼠游泳試驗不動時間及次數兩項指標，模型組與正常對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，阿普唑侖組、柴胡加龍骨牡蠣湯組分別與模型組相比在游泳試驗不動時間以及次數，均有差異(P<0.05)；柴胡加龍骨牡蠣湯與阿普唑侖組在游泳試驗不動時間以及次數，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　大鼠游泳試驗不動時間表±s)

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較，bP<0.05。

2.2曠場試驗

大鼠曠場試驗大鼠直立時間與運動總距離兩項指標，模型組與正常對照組相比均有差異(P<0.05)，阿普唑侖組、柴胡加龍骨牡蠣湯組分別與模型組相比均有差異(P<0.05)；柴胡加龍骨牡蠣湯與阿普唑侖組差異無統計學意義(P>0.05)。

表2　大鼠曠場實驗直立時間以及運動總距離表±s)

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較，bP<0.05。

3討論

單次延長應激(single-prolonged stress，SPS)是一種短時高強度的應激刺激，因其重復性良好以及能夠較好的模擬出PTSD所表現出的臨床癥狀，被廣泛應用于PTSD的實驗研究中，已成為一種國際通用的PTSD成熟的造模手段，其相關的生理、生化研究亦成為國內外研究熱點之一[7-9]。

強迫游泳試驗能較好的模擬當PTSD患者再次處于災難性事件發生的環境中時所表現出的強烈的恐懼感和無助感。在實驗過程中，以四肢僅作輕微擺動、保持頭部漂浮在水面以上，為放棄掙扎的標準并記錄游泳試驗不動時間，反映出PTSD大鼠再次處于SPS模型應激條件下所表現出的絕望[10]。曠場實驗能夠較好的評價嚙齒類實驗動物自主運動行為、探究行為與緊張度，從而反映出動物的整體的認知情況和焦慮狀態，是用來評價動物模型行為學變化的經典實驗之一[11]。相對于正常組，模型組大鼠在經歷SPS應激之后，游泳試驗不動時間延長、次數增多以及曠場實驗直立次數減少、運動總距離縮短，說明SPS應激能夠增加大鼠的恐懼行為以及抑制自發性活動，較好的模擬了臨床PTSD患者的無助感、反應性麻木以及探索能力下降的表現。

近代有中醫研究認為PTSD是在各種先后天因素所致心虛膽怯、肝郁不舒的基礎上，由“驚”而發，損傷人體氣機，引起臟腑、氣血津液失調，進而引起氣郁生火，心神被擾，神機失藏[12]。柴胡加龍骨牡蠣湯作為經方中治療神志類疾病的代表方劑，原方由柴胡、黃芩、生姜、鉛丹、人參、桂枝、茯苓、半夏、大黃、牡蠣、龍骨、大棗十二味藥物所組成，因鉛丹毒副作用較大，現代一般不使用。該方龍骨、牡蠣鎮驚安神，柴胡、桂枝升發宣散；黃芩、大黃清熱瀉火，茯苓、半夏健脾化痰；人參、大棗補虛，可調寒熱并調、升降并用、補虛泄實，共同發揮解郁瀉熱，鎮靜安神的功效，與PTSD病因病機不謀而合。

本實驗陽性對照藥物阿普唑侖，是目前治療PTSD最常用的藥物，研究表明應激后早期及時給予阿普唑侖干預可明顯減輕創傷后應激障礙大鼠的恐懼反應，能夠起到良好的對照作用[13-14]。在連續給藥14天后，柴胡加龍骨牡蠣湯組以及阿普唑侖組相對于模型組均表現出在游泳試驗中不動時間以及次數減少、曠場實驗總運動距離增加，且兩組之間無統計學差異(P>0.05)，表明柴胡加龍骨牡蠣湯對SPS建立的PTSD樣大鼠行為學具有調節作用，其作用效果與阿普唑侖無顯著差異。

綜上所述，柴胡加龍骨牡蠣湯對SPS模型建立的 PTSD 樣大鼠的行為學異常具有良好的調節作用，將柴胡加龍骨牡蠣湯運用于PTSD的動物實驗以進一步研究其調節機制，將對以PTSD的臨床治療提供實驗基礎。

參考文獻

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(本文編輯： 韓虹娟)

The regulating effect ofChaihujiaLongguMulidecoction (CLMD) on behavior responds of PTSD rats established by SPSCHENGuang-yao,WUZhuo-yun,ZHANGXin-ning,etal.BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstact】ObjectiveTo investigate the behavior changes and the influence of traditional Chinese prescriptionChaihujiaLongguMulidecoction (CLMD) on post traumatic stress disorder (PTSD) rats.MethodsThe open field test and forced swimming test was used to detect the change of the behavior of rats in different groups.Results(1)Compared with the normal group, the duration and the times of immobility of model group in forced swimming test were significantly higher (P<0.05). The vertical activity and total distance movement in the open fields of model group were significantly lower (P<0.05). (2)The vertical activity and total distance movement in Xanax group and CLMD group were both significantly higher than those of the model group (P<0.05). And the duration and the times of immobility in forced swimming test were significantly reduced in both Xanax group and CLMD group (P<0.05). All the parameters of CLMD group and Xanax group had no significant difference(P>0.05).ConclusionsThe PTSD model in rat is established successfully, and CLMD can significantly improve the abnormal behavior changes of the PTSD rats established by SPS model.

【Keywords】Post traumatic stress disorder；Chaihu jia Longgu Muli decoction；Single prolonged stress；Behavioral experiment

(收稿日期：2015-09-14)

Corresponding author:SONG Yue-han,E-mail：songyuehan1981@126.com

【中圖分類號】R285

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.02.003

作者簡介：陳光耀(1994- )，2012級本碩連讀本科階段在讀。研究方向：神經精神疾病病證結合研究。E-mail：chenguangyao1994@163.com通訊作者： 宋月晗(1981- )，女，副教授，碩士生導師。研究方向：神經精神疾病病證結合研究。E-mail：songyuehan1981@126.com

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃(201410026055)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金(20100013120005)