延緩衰老湯對衰老模型大鼠的保護作用

曹寶平　馬　超　李芳伶　葉厚春　曾令杰

(贛州市人民醫院藥劑科,江西　贛州　341000)

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延緩衰老湯對衰老模型大鼠的保護作用

曹寶平馬超李芳伶葉厚春1曾令杰2

(贛州市人民醫院藥劑科,江西贛州341000)

〔摘要〕目的探討延緩衰老湯(YT)對D-半乳糖所致衰老大鼠的保護作用。方法選擇健康SD大鼠40只，平均分成正常對照組、模型組、陽性對照組和給藥組。其中正常對照組不做任何處理，其余三組大鼠腹腔注射D-半乳糖和生理鹽水建立亞急性衰老模型，同時，陽性對照組灌胃維生素E，給藥組大鼠灌胃YT混懸液，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，連續培養2個月后，測定所有大鼠肝、腦組織中丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量、外周血清白細胞介素(IL)-2含量及腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力指標。結果與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠肝、腦組織中MDA含量明顯升高，SOD含量均顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組和給藥組肝、腦組織中MDA的含量明顯降低，SOD的含量明顯提高(P<0.01)。模型組大鼠血清IL-2的含量明顯低于正常對照組(P<0.01)；而陽性對照組和給藥組大鼠血清IL-2含量均顯著高于模型組(P<0.01)。模型組吸光度A值明顯低于正常對照組(P<0.01)；而陽性對照組和給藥組吸光度A值均顯著高于模型組(P<0.01)。結論YT通過降低肝、腦組織中MDA含量，提高SOD含量，提高血清中IL-2含量和腹腔巨噬細胞的吞噬能力來延緩D-半乳糖所致的大鼠衰老。

〔關鍵詞〕延緩衰老湯；抗衰老

1贛縣人民醫院藥劑科2尋烏縣人民醫院藥劑科。

第一作者：曹寶平(1973-)，男，副主任藥師，主要從事中醫藥研究。

報道顯示，衰老與機體體內的自由基數量不斷增加有緊密關系〔1〕。D-半乳糖模型是建立衰老和腦老化模型常用的誘發劑，廣泛應用于抗氧化、抗衰老實驗中[2]。延緩衰老湯(YT)是我院多年應用于抗衰老的中藥湯劑，由地黃、川芎、丹參等15種具有補腎益精、補氣養陰、壯腎陽、益精血的中藥組方而成，但其抗衰老機制仍不清楚。本研究旨在探討YT抗衰老能力的作用機制。

1材料與方法

1.1動物選擇健康SD大鼠40只，雌雄各半，體質量180~220 g，無特定病原體(SPF)級，由南方醫科大學實驗動物中心提供，適應性飼養1 w左右，環境溫度25℃±3℃，相對濕度為45%~70%，自由進食飲水。將大鼠40只隨機分為正常對照組、模型組、給藥組、陽性對照組，每組10只。正常對照組雌性4只，雄性6只，體質量(198±0.2)g；模型組雌性5只，雄性5只，體質量(200±0.25)g；給藥組雌性7只，雄性3只，體質量(197±0.3)g；陽性對照組雌性4只，雄性6只，體質量(203±0.1)g。四組雌雄比例、體質量相比，均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2藥品與試劑YT配制：取地黃30 g，川芎6 g，丹參20 g，當歸10 g，澤瀉10 g，紅花6 g，黨參15 g，桃仁10 g，白術10 g，首烏15 g，田七8 g，茯苓15 g，熟地12 g，甘草3 g，枸杞6 g加入適量滅菌注射用水中，100℃煎煮1 h，過濾，調配成1 g/ml的YT，取濾液放冷密封，4℃儲存。D-半乳糖(Sigerma進口分裝，批號1212495)：廣州華科化學技術有限公司；白細胞介素(IL)-2、丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供，批號：20120325。

1.3儀器UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；BC-J80S型細胞培養箱，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.4方法

1.4.1D-半乳糖衰老模型的建立及給藥正常對照組大鼠給予生理鹽水1 ml/d腹腔注射，其他各組給予100 mg·L-1·d-1D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續2個月。同時2個月中給藥組給予100 mg·kg-1·d-1延緩衰老湯灌胃，陽性對照組給予灌胃25 mg·kg-1·d-1維生素E，其他兩組以等量生理鹽水灌胃。2個月后，所有大鼠內眥靜脈取血，處死大鼠。

1.4.2肝、腦組織中MDA和SOD含量測定使用20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，斷頸處死大鼠，取出肝、腦組織，取材后立即存放在液氮中，然后使用冰冷的生理鹽水清洗組織表面的血液，使用濾紙吸干表面殘余的水分，放入小燒杯中，冰浴，稱重。在小燒杯中加入生理鹽水，剪碎臟器，倒入勻漿機，手工勻漿10 min，3 000 r/min離心15 min，取肝、腦組織勻漿上清備用，按試劑盒操作檢測SOD、MDA含量。

1.4.3測定外周血IL-2含量藥物干預后，從大鼠內眥靜脈取血置于離心管中，靜置30 min后，3 000 r/min離心15min，取血清，按照試劑盒說明書操作，放射免疫法測定IL-2含量。

1.4.4腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力檢測無菌收集大鼠腹腔液，4℃離心，10 min，Hank液洗滌細胞3次，1640培養液制備細胞懸液。取3 ml置培養皿中，37℃，5%CO2培養2 h，巨噬細胞黏附于容器表面，用4℃ Hank液吹吸，收集黏附細胞，血球計數板計數并調整細胞密度為2×109/L，置37℃培養箱培養2 h后，棄上清和非貼壁細胞。取貼壁巨噬細胞，加0.1%中性紅生理鹽水，37℃繼續培養30 min，棄中性紅，用37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗巨噬細胞，用50%乙酸和50%乙醇稀釋后，用UV-2550紫外分光光度計在540 nm波長測A值。

1.5統計學方法應用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1肝、腦組織中MDA和SOD含量與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠肝、腦組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD含量均顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組和給藥組肝、腦組織中MDA的含量明顯降低，SOD的含量明顯提高(P<0.01)；但是給藥組與陽性對照組大鼠MDA和SOD含量均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　肝、腦組織中MDA和SOD含量測定結果

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.2大鼠血清IL-2含量模型組大鼠血清IL-2的含量為(3.29±0.16)ng/ml，明顯低于正常對照組的(5.23±0.15)ng/ml(P<0.01)；而陽性對照組和給藥組大鼠血清IL-2含量分別為(5.10±0.08)ng/ml、(5.04±0.14)ng/ml，均顯著高于模型組(P<0.01)，但正常對照組、陽性對照組和給藥組大鼠血清中IL-2的含量之間無統計學意義(P>0.05)。

2.3腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力模型組吸光度A值為(0.15±0.04)，明顯低于正常對照組的(0.30±0.01)(P<0.01)；且陽性對照組和給藥組吸光度A值分別為(0.29±0.03)、(0.27±0.05)，均顯著高于模型組(P<0.01)。但正常對照組、陽性對照組和給藥組吸光度A值之間無統計學意義(P>0.05)。

3討論

關于衰老的機制有很多學說，具有代表性的是自由基學說。長期以來機體內部自由基的產生和自由基的清除處于平衡狀態，隨著年齡的增長，機體內部發生一系列變化，平衡狀態被打破，引起自由基數量增加〔3〕。過多的自由基會攻擊核酸、蛋白質等大分子物質，誘導細胞膜上不飽和脂肪酸發生過氧化反應，引起核酸及蛋白質相互交聯，基因突變及生物酶活力下降，導致細胞受損，甚至衰老至死亡〔4〕。另外，在發生衰老的過程中，與人體免疫功能下降之間具有緊密聯系。現代藥理學實驗證明具有補腎益精的中藥方劑可以提高老年大鼠血清中甲狀腺素水平，從而增強胸腺的功能，延緩衰老，促進胸腺上皮細胞合成和分泌IL-2，最終達到增強衰老大鼠的免疫功能[5]。YT可以通過多系統、多環節維持機體的免疫功能，從而延緩衰老。建立衰老模型是評價抗衰老模型的關鍵，實驗中衰老動物模型主要有D-半乳糖衰老模型、臭氧衰老模型、去胸腺衰老模型及自然衰老模型等，其中D-半乳糖衰老模型應用最廣泛，具有操作簡單、低成本、效果佳等特點〔6〕。本研究主要考慮到D-半乳糖在還原酶的作用下可以生成半乳糖醇，而半乳糖醇不被細胞代謝而在細胞內沉積，從而增加細胞的滲透壓，影響細胞的代謝，誘導細胞發生衰老〔7〕。

SOD是機體重要的抗氧化酶之一，可以清除H2O2、·OH和 O-2·等自由基，在體內的含量可以反映出機體清除自由基的能力高低，可以保護細胞免受氧化損傷，隨著年齡的增長，其數量及活性逐漸下降，是衡量衰老程度的重要指標〔8〕。MDA是脂質發生過氧化反應的產物，當機體衰老后，機體內MDA的含量會慢慢升高，從而反映氧自由基水平和過氧化反應的程度〔9〕，也可以用于反映機體的衰老狀態。本研究提示YT和維生素E可以有效對抗D-半乳糖所致大鼠肝、腦的氧化損傷，均有清除自由基和抗氧化的作用，并且達到延緩衰老的目的。而且YT與維生素E的功效相似。近年來研究表明，YT中組方成分地黃、丹參、首烏、枸杞等具有抗自由基代謝、提高免疫力、防治心腦血管疾病、抗老年癡呆等功效〔10〕。衰老機體的免疫功能及非特異性免疫中巨噬細胞功能下降〔11〕，而IL-2主要由活化的CD4+和CD8+T細胞產生，是調控免疫應答的主要因子，本研究表明YT和維生素E可以改善衰老大鼠的免疫功能，從而延緩衰老的進程。

綜上所述，YT可以通過降低MDA的含量，升高SOD的含量，清除自由基，達到抗氧化的目的，同時也具有增強免疫功能的作用，兩個作用結合起來延緩衰老的進程，具有一定的開發價值。

4參考文獻

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〔2015-04-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：馬超(1984-)，男，碩士，主管藥師，主要從事臨床藥學方面的研究。

基金項目：贛州市2012年市科技局指導性科技計劃項目(No.2012006)

〔中圖分類號〕R28

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0547-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.013