β-淀粉樣蛋白誘導HT22細胞建立阿爾茨海默病細胞模型

孫鳳芹　羅紅波　張菲菲　程艷偉　石向群

(蘭州軍區蘭州總醫院神經內科，甘肅　蘭州　730050)

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β-淀粉樣蛋白誘導HT22細胞建立阿爾茨海默病細胞模型

孫鳳芹羅紅波張菲菲程艷偉石向群

(蘭州軍區蘭州總醫院神經內科，甘肅蘭州730050)

〔摘要〕目的探討β-淀粉樣蛋白(Aβ25~35)誘導HT22細胞建立阿爾茨海默病(AD)細胞模型。方法將HT22 細胞分為未分化組和分化組，未分化組加入完全培養基培養48 h，分化組為完全培養基貼壁生長24 h后加入分化液(Neurobasal 培養基和N2添加劑)培養24 h，Western印跡檢測兩組細胞ATF6、PERK、IRE1蛋白表達量的變化。不同濃度的Aβ25~35分別作用于兩組HT22細胞24 h，用MTT測定細胞活力變化。結果ATF6、PERK、IRE1蛋白在未分化組的表達量明顯高于分化組。Aβ25~35對未分化組細胞雖有損傷作用，但各組間無明顯差異，且無劑量依賴關系。Aβ25~35可以誘導分化組HT22細胞發生損傷，且呈劑量依賴關系，Aβ25~35(20 μmol/L、40 μmol/L)作用于分化組HT22細胞24 h，細胞存活率分別為66%、60%，AD模型最佳。結論Aβ25~35(20 μmol/L)誘導分化型HT22細胞可建立最佳AD細胞模型。

〔關鍵詞〕β-淀粉樣蛋白；HT22細胞；阿爾茨海默病細胞模型

第一作者：孫鳳芹(1989-)，女，在讀碩士，主要從事腦血管病研究。

建立良好的阿爾茨海默病(AD)模型有助于從細胞和分子水平進一步研究AD的發病機制和治療方法?，F常用β-淀粉樣蛋白(Aβ)誘導細胞反應建立AD模型，主要涉及原代培養神經元、神經嵴源細胞、神經膠質細胞、非神經細胞、基因工程細胞及雜交組織細胞等〔1〕。HT22細胞是HT4細胞的亞克隆，為一種永生化的小鼠海馬神經元細胞，具有生長穩定、易獲得的特點。在體外研究的情況下，分化液處理后的HT22細胞，軸突、樹突變得更長，細胞更接近體內海馬神經元的狀態〔2〕。MTT檢測細胞活力時，加入抑制細胞生長類藥物后，細胞存活率為60%~80%時，細胞模型建立成功〔3〕。本實驗研究不同濃度Aβ25~35分別誘導兩組細胞建立細胞模型后細胞活力的變化。

1材料與方法

1.1實驗材料與儀器HT22細胞株購自廣州吉妮歐公司；Aβ25~35購自Sigma公司；MTT、二甲基亞砜購自Amersco公司；DMEM高糖培養基購自Hyclone公司；2.5 g/L胰蛋白酶、Neurobasal培養基和N2添加劑均購自Gibco 公司；MTT為國產分析純試劑。主要儀器包括德國memmert公司恒溫CO2培養箱，奧林巴斯TH4-200倒置熒光顯微鏡，瑞士Tecan Infinite M200型多功能酶標儀。

1.2細胞培養、分化及藥物處理HT22細胞隔4 d傳一代，傳代前一天半量換液。HT22細胞未分化組為不添加任何藥物的等體積的完全培養基。HT22細胞分化組為完全培養基傳代培養24 h后，加入分化液進行細胞分化處理24 h〔4，5〕。Aβ25~35使用前1 w取出至37℃孵育，10 d后取出分別用完全培養基和分化液稀釋至工作濃度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L。

1.3蛋白印跡法檢測ATF6、PERK、IRE1蛋白表達將分化組和未分化組(兩組均未加入Aβ25~35)細胞培養后加入冷PBS洗2次后加入細胞裂解液進行裂解，離心棄沉淀，吸出上清液用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液混勻，100℃變性5 min，行10%和8% SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。4℃孵育一抗anti-ATF6(1∶1 000)、anti-PERK(1∶500)、anti-IRE1(1∶500)過夜。TBST洗膜4次，每次8 min，室溫下孵育二抗(1∶5 000)2 h，TBST洗膜4次，每次8 min，使用美國UVP ChemiDoc-It化學發光成像系統曝光，ipp軟件進行分析。

1.4細胞活力測定取對數生長的HT22細胞，以8×103/孔的密度種植至96孔細胞培養板中，未分化組細胞貼壁生長48 h后，棄完全培養基，加入不完全培養基稀釋不同濃度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)；分化組細胞傳代后加入完全培養基培養24 h后，加入分化液進行細胞分化處理24 h后，棄分化液，加入分化液稀釋的不同濃度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，24 h后每孔加入20 μl的MTT 5 mg/ml試劑，于37℃、體積百分數為5%CO2培養箱內溫育4 h，棄掉培養基，每孔加入DMSO 150 μl，用酶標儀于490 nm波長處測定各孔的吸光度，扣除空白孔中本底的吸光度，結果以各處理組與陽性對照組的比值作為相對細胞活力。

1.5統計學處理采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1兩組細胞ATF6、PERK、IRE1蛋白表達量的變化未分化組ATF6、PERK、IRE1蛋白表達量較分化組明顯增多。見圖1。

圖1　內質網應激蛋白在分化組與未分化組表達情況

2.2HT22細胞活力

2.2.1未分化型HT22細胞活力測定當不同濃度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)作用于完全培養基培養下的未分化型HT22細胞，HT22細胞活力無明顯的劑量依賴關系；而且無論Aβ25~35劑量多少，只要加入培養基中，細胞便會出現大量的死亡。見圖2。

圖2　MTT法測定Aβ25~35對未分化型及分化型HT22細胞活力的影響

2.2.2分化型HT22細胞活力測定當不同濃度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)作用于分化液處理后的分化型HT22細胞，HT22細胞活力呈劑量依賴性下降(P<0.05)，高濃度的Aβ25~35對細胞有明顯的毒性作用，隨濃度減低細胞毒性作用減低。當Aβ25~35(20 μmol/L)作用于分化型HT22細胞24 h，細胞存活率為66%，細胞模型最佳。見圖2。

3討論

Aβ由39～43個氨基酸組成，其活性片段主要在第 25～35個氨基酸殘基。Aβ具有神經營養和神經毒性的雙重生物活性。Aβ在較高濃度時，對HT22細胞的神經毒性作用遠大于神經營養作用〔6〕。

本實驗培養細胞時，在參照文獻〔2~4〕的基礎上進行了進一步的改進：①胎牛血清的濃度為8%，②96孔板種植細胞的濃度為8×103/孔，③以1∶4傳代，④未加青霉素-鏈霉素雙抗，⑤用0.9的生理鹽水稀釋Aβ25~35。反復培養HT22細胞發現，HT22細胞傳代非常穩定，且繁殖能力很強，適當降低血清濃度、減少種植密度可以減慢細胞生長速度，促進細胞長出軸突、樹突，充分表現出神經元的特性。未加雙抗，細胞未發生污染，且避免了對細胞的損傷作用。Aβ25~35可以溶解在生理鹽水里，第二次溶解時出現少量的不溶物，加入少量的酸后完全溶解。特殊說明的是，HT22細胞傳代時，用胰酶消化后，顯微鏡下觀察細胞軸突樹突消失，細胞彼此分離開后，棄胰酶加入完全培養基，反復吹打至少100次，不需進行離心，以1∶4傳代，第二日觀察細胞單個分布，生長狀態良好。

本實驗表明未分化型細胞處于應激活躍狀態，與HT22細胞體內狀態差距較大，不易建立細胞模型。HT22細胞未分化狀態下，Aβ25~35對其有損傷作用，但無劑量依賴關系；而分化型細胞加入Aβ25~35后，細胞活力出現劑量依賴性的下降。

綜上，我們認為在建立 AD 細胞模型時，選用20、40 μmol/L Aβ25~35作用于分化型HT22細胞24 h，從生化特性、細胞活力及形態學改變等角度，可作為較理想的AD細胞模型。

4參考文獻

1Lloret A，Fuchsberger T，Giraldo E，etal.Molecular mechanisms linking amyloid β toxicity and Tau hyperphosphorylation in Alzheimer′s disease〔J〕.Free Radic Biol Med,2015；83(2)：186-91.

2Zhao Z，Lu R，Zhang B，etal.Differentiation of HT22 neurons induces expression of NMDA receptor that mediates homocysteine cytotoxicity〔J〕.Neurol Res,2012；34(1)：38-43.

3張云鶴，張一娜，劉歆,等.Aβ1~42誘導原代海馬神經細胞建立阿爾茨海默病細胞模型〔J〕.中國老年學雜志,2011；31(11)：2027-9.

4Liu J，Li L，Suo WZ.HT22 hippocampal neuronal cell line possesses functional cholinergic properties〔J〕.Life Sci,2009；84(9-10)：267-71.

5Suo Z，Wu M，Citron BA，etal.Rapid tau aggregation and delayed hippocampal neuronal death induced by persistent thrombin signaling〔J〕.J Biol Chem,2003；278(39)：37681-9.

6張蓓，谷貝貝，范勝諾,等.β-淀粉樣蛋白Aβ25~35誘導HT22細胞自噬及其對V-ATPase表達的影響〔J〕.中山大學學報,2013；34(1)：1-5.

〔2015-12-29修回〕

(編輯袁左鳴/徐杰)

Aβ25~35induced HT22 cells to become AD cells model

SUN Feng-Qin, LUO Hong-Bo, ZHANG Fei-Fei,etal.

Department of Neurology, Lanzhou General Hospital Lanzhou Command, Lanzhou 730050, Gansu, China

【Abstract】ObjectiveTo explore Aβ25~35induced HT22 cells to establish AD cells model.MethodsHT22 was divided into undifferentiated and differentiated groups.The undifferentiated group was cultured for 48 hours with complete culture medium.The differentiated group was cultured for 24 hours with complete culture medium , following the differentiation medium (Neurobasal medium and N2 additive) was added for 24 hours.The expressions of IRE1, PERK and ATF6 in the two groups were detected by Western blot.ResultsThe expressions of ATF6, PERK and IRE1 in undifferentiated group were significantly higher than those in differentiation group. Aβ25~35on undifferentiated group cell was injured, but the injury was not in accordance with the increase of drug concentration increased. Aβ25~35induced differentiation of HT22 cells that were damaged, and the damage was in accordance with the increase of drug concentration increased. Aβ25~35(20,40 μmol/L) effects on HT22 cell differentiation for 24 hours,which the cell survival rate were 66% and 60%.In this case, the establishment of the cell model was the best AD model.ConclusionsAβ25~35(20 μmol/L) induces differentiated HT22 cells to establish the best model of AD cells.

【Key words】Aβ25~35；HT22 cells； AD cells model

通訊作者：石向群(1964-)，男，主任醫師，博士后，主要從事腦血管病研究。

基金項目：國家自然科學基金(81303097)；甘肅省自然科學基金(1308RJZA304)

〔中圖分類號〕R74

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0521-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.004