豚鼠早期實(shí)驗(yàn)性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞前部及后極部TGF-β2表達(dá)變化的研究

陳博宇 王超英 陳維毅

·實(shí)驗(yàn)研究·

豚鼠早期實(shí)驗(yàn)性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞前部及后極部TGF-β2表達(dá)變化的研究

陳博宇1王超英1陳維毅3

目的 研究豚鼠早期實(shí)驗(yàn)性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞前部及后極部轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)的改變,探索近視的發(fā)病機(jī)制。方法 2周齡豚鼠30只隨機(jī)分為A、B、C組,每組10只,再隨機(jī)選取5只(10眼)正常2周齡豚鼠不作任何干預(yù),作為正常對(duì)照眼。選取任意眼戴一10 DS凹透鏡,分別飼養(yǎng)6天、15天、30天后除去鏡片,驗(yàn)光及測(cè)眼軸長(zhǎng)度確定近視形成后,采用細(xì)胞酶消化法培養(yǎng)豚鼠的前部及后極部RPE細(xì)胞,取3～6代RPE細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、western-blot蛋白印跡法檢查前部及后極部RPE細(xì)胞TGF-β2及其mRNA、蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 TGF-β2的表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組中前部RPE細(xì)胞于15天陽(yáng)性表達(dá)率較高,30天陽(yáng)性表達(dá)率最高;后極部RPE細(xì)胞于6天表達(dá)率開(kāi)始較高,至15天陽(yáng)性表達(dá)率最高,以后保持較高的陽(yáng)性表達(dá)率,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。結(jié)論 體外培養(yǎng)的豚鼠RPE細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)TGF-β2、TGF-β2 mRNA及其蛋白。且前部RPE細(xì)胞于誘導(dǎo)15天開(kāi)始陽(yáng)性表達(dá)率較高;后極部RPE細(xì)胞于誘導(dǎo)6天開(kāi)始陽(yáng)性表達(dá)率較高。后極部RPE細(xì)胞較前部RPE細(xì)胞表達(dá)差異有顯著性。

豚鼠; 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2; 免疫細(xì)胞化學(xué); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; Western-blot蛋白印跡法

視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞位于視網(wǎng)膜感覺(jué)上皮層與脈絡(luò)膜之間,聯(lián)系上皮與間充質(zhì),與多種細(xì)胞因子的分泌有關(guān),對(duì)于穩(wěn)定和維持視網(wǎng)膜功能有重要的作用,并且參與眼內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)作為一種近視發(fā)生的信號(hào)分子,由RPE細(xì)胞分泌,并通過(guò)受體傳遞,逐級(jí)將信息傳遞到鞏膜組織,進(jìn)而影響鞏膜細(xì)胞的增殖和(或)細(xì)胞外基質(zhì)的合成或降解,使鞏膜重新塑形,眼軸過(guò)度延長(zhǎng),形成近視。眾所周知,近視眼形成的病理及生化改變存在的不同部位的差異,其變化主要發(fā)生在后極部,那么是否影響鞏膜重塑的RPE細(xì)胞所分泌的因子也存在部位的差異？目前人們對(duì)豚鼠透鏡誘導(dǎo)近視眼RPE細(xì)胞中TGF-β2的表達(dá)變化的研究罕有報(bào)道,而不同部位RPE細(xì)胞分泌因子的差異更無(wú)人報(bào)道,為此,本研究在成功建立透鏡誘導(dǎo)近視眼模型的基礎(chǔ)上,定位到前部及后極部RPE細(xì)胞,分析不同部位的TGF-β對(duì)在近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起所起的作用,為進(jìn)一步在細(xì)胞因子水平,對(duì)病理性近視眼發(fā)生機(jī)制的研究提供補(bǔ)充和相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 隨機(jī)選取2周齡已脫離母乳喂養(yǎng)的小豚鼠30只(60只眼)分為A、B、C組,A組10只,B組10只,C組10只,再隨機(jī)選取5只(10眼)正常2周齡豚鼠不作任何干預(yù),作為正常對(duì)照眼(Norma-contro,NC組),雌雄不限,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。制備A、B、C組的LIM動(dòng)物模型,誘導(dǎo)眼為實(shí)驗(yàn)組(LIM組),對(duì)側(cè)眼為自身對(duì)照組(SC組)。實(shí)驗(yàn)眼是采用離焦點(diǎn)的方法用-10.00D[1]凹透鏡誘導(dǎo)成近視眼模型。遮蓋時(shí)間分別為6天、15天、30天。幼豚鼠于室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化喂養(yǎng),白天用自然光照射,每日光照與黑暗的周期比例為14:10,室溫控制在20℃。

1.1.2 凹透鏡片(自行設(shè)計(jì)的 PMMA 鏡片,部分參數(shù)如下:鏡片直徑 11.0mm,光學(xué)直徑9.5mm,基弧為9.0,屈光度均為-10.00D上海菲士康視光有限公司)。

1.1.3 試劑

F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Gibico公司);胎牛血清、小牛血清(杭州四季青公司);培養(yǎng)瓶、六孔板(美國(guó)Corning公司)。兔抗鼠Vimentin、Desmin、keratin、S-100I抗及免疫組化的劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2)、(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Trozol Invitrogen公司USA;RNase Inhibitor Promega公司USA;M-MLV RT酶Promega公司USA;DNTP Promega公司USA;Taq酶(5u/μl)Sigma公司USA。

1.2 方法

1.2.1 RPE細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

將豚鼠標(biāo)記編號(hào),驗(yàn)光及測(cè)眼軸長(zhǎng)度。將三組豚鼠分別喂養(yǎng)6、15、30天后,摘除鏡片,按前述方法驗(yàn)光及測(cè)眼軸長(zhǎng)度。采用細(xì)胞酶消化法培養(yǎng)豚鼠的RPE細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

將長(zhǎng)有RPE細(xì)胞的蓋玻片放入濕盒內(nèi),每張玻片加50μl Triton室溫下通透15分鐘,PBS沖洗3×5min。鏈親和霉素-過(guò)氧化物酶溶液浸泡6min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,PBS沖洗3×5min。高壓鍋加熱抗原修復(fù)液處理2min,室溫冷卻20min,PBS沖洗3×5min。滴加稀釋的50μl一抗(37℃孵育60min,PBS沖洗3×5min。滴加生物素標(biāo)記的50μl二抗,室溫40min,PBS沖洗3×5 min。DAB顯色,取Iml蒸餾水加試劑盒中A,B,C試劑各一滴,混勻后加至玻片上,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在5-10min之間(胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性),蒸餾水充分洗滌終止顯色時(shí)間。自來(lái)水充分沖洗,蘇木素復(fù)染10min,梯度脫水,中性樹(shù)脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性空白對(duì)照:以PBS代替一抗,作陰性對(duì)照。

1.2.2.2 結(jié)果判定

由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科技師采用雙盲法獨(dú)立觀察,每張細(xì)胞爬片觀察高倍鏡(LM×400)下3個(gè)視野,陽(yáng)性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒。陰性無(wú)表達(dá);+著色淺,成淡黃色 高倍鏡下明確陽(yáng)性;++ 著色中等,棕黃色 低倍鏡下明確陽(yáng)性;+++ 大量,棕色 著色深;++++ 密集片狀,深棕色 著色強(qiáng)烈。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TGF-βmRNA

1.2.3.1 目的基因引物的合成

引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:GAPDH上游引物:5’-TGAACGGGAAGCTCAC TGG-3’下游引物:3’-GCTTCACCACCTTCTTGAT GTC-3’TGFβ124bp5’-CCCAGAGTGGTTGTCCT TTGA-3’5’-GCGGAGCGT GTTATCTTTGCT-3’

1.2.3.2 提取RNA的完整性檢測(cè)及提取RNA的定量

標(biāo)本及組織總RNA留取后,取RNA溶液4ul,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),明顯可見(jiàn)28S、18S條帶,且28S為18S條帶的兩倍,5S條帶較弱,且彌散,表明RNA降解較少,完整性良好。用756型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定OD260與OD280,OD260/OD280比值在1.8-2.0之間,表明提取的RNA蛋白污染很少,因此可于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用756型紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD260/OD280比值,可檢測(cè)RNA的純度和含量,選用OD260/OD280比值為1.8-2.0的RNA用作反轉(zhuǎn)錄。RNA含量采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)法。

1.2.3.3 Syber Green熒光定量PCR檢測(cè):(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I),BBI)

PCR熱循環(huán)參數(shù):96℃ 4min,然后三步反應(yīng):94℃ 30S,58℃ 30s,72℃ 30s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),于每個(gè)循環(huán)的第三步72℃ 30s收集熒光信號(hào)。選擇數(shù)據(jù)分析方式,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析。本試驗(yàn)采用相對(duì)定量法中的CT值比較法檢驗(yàn)基因的表達(dá)變化。擴(kuò)增完畢后,進(jìn)入結(jié)果分析界面,以GAPDH為內(nèi)參照基因,與對(duì)照組相比,得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值),我們將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 western-blot印跡法從蛋白表達(dá)水平定量檢測(cè)TGF-β

1.2.4.1 蛋白質(zhì)抽提及定量

收集各組細(xì)胞,用冷PBS洗滌3次后,將細(xì)胞重懸于細(xì)胞裂解液中,冰浴6 min,使細(xì)胞充分裂解。離心,收集上清,分裝凍存。配置BCA工作液(WR);分別吸25ul標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品.至微孔板對(duì)應(yīng)孔中,每孔加入200ul的WR,震板6秒以徹底混合均勻:蓋好微孔板,37℃孵育6分鐘:冷卻至室溫;測(cè)量各孔590nm的吸光度值;測(cè)得的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔的吸收值分別減去空白孔平均光吸收值;以校正過(guò)的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)量值對(duì)其濃度(ug/ml)做圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測(cè)樣品蛋白濃度。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)PVDF膜

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后對(duì)凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜緩沖液為48 mmol/L Tris,39 mmol/L甘氨酸,1.3 mmol/L SDS,20 % 甲醇,pH 9.2)。半干式轉(zhuǎn)膜槽陰極在上,陽(yáng)極在下。緩沖液為連續(xù)緩沖液,蛋白質(zhì)移動(dòng)方向由上而下。轉(zhuǎn)移電流50～250 mA,轉(zhuǎn)移時(shí)間20～60 min。封閉:轉(zhuǎn)膜完畢,取出 PVDF 膜,置于含5 % 脫脂奶粉的TTBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,60 mmol/L NaCl,0.05 % Tween-20)封閉液中,于室溫封閉2 h。一抗結(jié)合:將封閉后的PVDF膜置入TTBS適當(dāng)稀釋的一抗溶液中,4 ℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。洗膜:取出PVDF膜放入盛有適量TTBS的平皿中,室溫洗膜,每次10 min,共3次。二抗結(jié)合:將PVDF膜置入適量以TTBS 1:10000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中,于室溫反應(yīng)2 h。化學(xué)發(fā)光法檢測(cè):用TTBS室溫洗膜3次,每次10 min,然后用TBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,60 mmol/L NaCl)洗膜1次,約5 min。抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。信號(hào)強(qiáng)度用Bio 1D圖像分析軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.5 盲法處理

以上檢影驗(yàn)光及所有測(cè)量均山另一位專(zhuān)業(yè)人員操作,操作人員不知被檢眼是實(shí)驗(yàn)眼還是對(duì)照眼。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定結(jié)果

細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定顯示:RPE細(xì)胞keratin染色陽(yáng)性,胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量棕色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物,S-100染色弱陽(yáng)性,胞漿內(nèi)多呈棕黃色,Vimentin染色陰性,Desmin染色陰性,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為RPE細(xì)胞(Fig 1A-D)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法結(jié)果

TGF-β2的表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。各誘導(dǎo)時(shí)間段前部及后極部RPE細(xì)胞均有TGF-β2的表達(dá),LIM組前部及后極部與SC組相應(yīng)前部及后極部比較,LIM組中TGF-β2的陽(yáng)性表達(dá)率高于SC組,差異有顯著意義(P<0.05)。LIM組中前部RPE細(xì)胞于15天陽(yáng)性表達(dá)率較高,30天陽(yáng)性表達(dá)率最高;后極部RPE細(xì)胞于6天表達(dá)率開(kāi)始較高,至15天陽(yáng)性表達(dá)率最高,以后保持較高的陽(yáng)性表達(dá)率,差異有顯著性(P<0.05);后極部RPE細(xì)胞于30天較前部RPE細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率仍有差異,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無(wú)顯著意義(P>0.05)(Fig 4 A～F,Table 1)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

各誘導(dǎo)時(shí)間段前部及后極部RPE細(xì)胞均有TGF-β2mRNA的表達(dá),LIM組前部及后極部與SC組相應(yīng)前部及后極部比較,LIM組中TGF-β2mRNA的表達(dá)量高于SC組,差異有顯著意義(P<0.05)。LIM組中前部RPE細(xì)胞于15天表達(dá)量較高,至30天表達(dá)量最高;后極部RPE細(xì)胞于6天表達(dá)量較高,至15天表達(dá)量最高,以后保持較高的表達(dá)量,差異有顯著性(P<0.05);后極部RPE細(xì)胞于30天較前部RPE細(xì)胞表達(dá)量仍有差異,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。(Fig 3,Table2)。

2.4 western-blot印跡法結(jié)果

各誘導(dǎo)時(shí)間段前部及后極部RPE細(xì)胞均有TGF-β2蛋白的表達(dá),LIM組前部及后極部與SC組相應(yīng)前部及后極部比較,LIM組中TGF-β2蛋白的表達(dá)量高于SC組,差異有顯著意義(P<0.05)。LIM組中前部RPE細(xì)胞于15天表達(dá)量較高,至30天表達(dá)量最高;后極部RPE細(xì)胞于6天表達(dá)量較高,至15天表達(dá)量最高,以后保持較高的表達(dá)量,差異有顯著性(P<0.05);后極部RPE細(xì)胞于30天較前部RPE細(xì)胞表達(dá)量仍有差異,差異有顯著性(P<0.05);SC組各組自身前部及后極部比較,差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。(Fig 2,Table 3)

圖1 豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定結(jié)果(×400)A:keratin(+);B:S-100(±);C:Vimentin(-);D:Desmin(-)

圖2 豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中TGF-β蛋白表達(dá)1:對(duì)照組前部;2:實(shí)驗(yàn)組前部(6days);3:實(shí)驗(yàn)組前部(15days);4:實(shí)驗(yàn)組前部(30days);5:對(duì)照組后極部;6:實(shí)驗(yàn)組后極部(6days);7:實(shí)驗(yàn)組后極部(15days);8:實(shí)驗(yàn)組后極部(30days)

Note:*P<0.05圖3 豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中TGF-βmRNA表達(dá)的對(duì)比1:實(shí)驗(yàn)組前部;2:實(shí)驗(yàn)組后極部;3:對(duì)照組前部;4:對(duì)照組后極部

圖4 豚鼠RPE細(xì)胞中TGF-β的細(xì)胞免疫化學(xué)法陽(yáng)性表達(dá)(×400)A:實(shí)驗(yàn)組前部(30days);B:實(shí)驗(yàn)組后極部(30days);C:實(shí)驗(yàn)組前部(15days);D:實(shí)驗(yàn)組后極部(15days);E:實(shí)驗(yàn)組前部(6days);F:實(shí)驗(yàn)組后極部(6days);G:對(duì)照組前部;H:對(duì)照組后極部

TGF-β2時(shí)間組別部位眼數(shù)-++++++++++陽(yáng)性率誘導(dǎo)前實(shí)驗(yàn)組前部105122050%后極部105131050%對(duì)照組前部106211040%后極部105320050%6天后實(shí)驗(yàn)組前部104112260%c后極部101123390%a,b對(duì)照組前部106211040%c后極部105320050%c15天后實(shí)驗(yàn)組前部102031480%a,b后極部1000136100%a,b對(duì)照組前部105211150%c后極部104321060%c30天后實(shí)驗(yàn)組前部101022590%a,b后極部1000136100%a,b對(duì)照組前部107111030%c后極部106121040%c

注:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較aP<0.05;實(shí)驗(yàn)組與誘導(dǎo)前比較;bP<0.05,對(duì)照組與誘導(dǎo)前比較;cP>0.05

表2 RPE細(xì)胞中不同時(shí)期TGF-βmRNA表達(dá)的對(duì)比

注:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較aP<0.05,實(shí)驗(yàn)組與誘導(dǎo)前比較bP<0.05,對(duì)照組與誘導(dǎo)前比較cP>0.05

表3 RPE細(xì)胞中不同時(shí)期TGF-β蛋白表達(dá)的對(duì)比

續(xù)表3

時(shí)間點(diǎn)組別部位TGF-ββ-actionTGF-β與β-action的OD比值后極部95.367±2.153522.56±5.3780.1824±0.004c15天后實(shí)驗(yàn)組前部115.48±3.756522.13±5.5690.2211±0.008a,b后極部463.01±6.825520.34±4.8570.8898±0.015a,b對(duì)照組前部93.145±1.879518.37±5.4410.179±0.003c后極部98.215±1.285524.93±3.9910.1871±0.003c30天后實(shí)驗(yàn)組前部273.42±6.287523.16±3.5130.5210±0.014a,b后極部317.59±4.910524.78±3.0060.607±0.012a,b對(duì)照組前部99.147±1.740517.46±2.2340.1916±0.004c后極部96.582±2.315516.28±6.0390.1870±0.005c

注:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較aP<0.05,實(shí)驗(yàn)組與誘導(dǎo)前比較bP<0.05,對(duì)照組與誘導(dǎo)前比較cP>0.05

3 討論

TGF-β是一類(lèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化具有雙向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,它產(chǎn)生、利用和降解的部位主要在眼球的后極部,高表達(dá)于光感受器外節(jié)和RPE細(xì)胞,在脈絡(luò)膜也有輕度表達(dá),具有促進(jìn)和抑制鞏膜成纖維細(xì)胞的增生,從而進(jìn)一步影響細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成,其生物活性以TGF-β2為主[2]。在生理狀態(tài)下,RPE細(xì)胞與TGF-β的關(guān)系極為密切:目前研究已知不僅眼后段TGF-β的表達(dá)和分泌的重要來(lái)源地主要位于RPE細(xì)胞[3],而且反過(guò)來(lái),通過(guò)自分泌或旁分泌產(chǎn)生的TGF-β還可以抑制RPE細(xì)胞增生[4]。另外,依據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的不同及與其他因子的共同作用的條件下,TGF-β又可發(fā)揮抑制或促進(jìn)效應(yīng),從而達(dá)到雙向調(diào)節(jié)眼內(nèi)細(xì)胞間的活動(dòng)的目的。以往的研究證實(shí),當(dāng)把外源性TGF-β加入人胚RPE細(xì)胞的培養(yǎng)基后,RPE細(xì)胞DNA的合成表現(xiàn)為抑制反應(yīng)[5]。在研究小雞形覺(jué)剝奪性近視(FDM)模型中,Seko[6]等人發(fā)現(xiàn)后極部鞏膜組織及視網(wǎng)膜―視網(wǎng)膜色素上皮―脈絡(luò)膜復(fù)合體中TGF-β2均有明顯增加。TGF-β在實(shí)驗(yàn)性近視中或人眼近視中的可能機(jī)制為:在病理性近視眼的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,TGF-β可能作為一種“啟動(dòng)”信號(hào)因子,其表達(dá)水平顯著升高[6,7],并經(jīng)過(guò)與受體相結(jié)合,通過(guò)特定的信號(hào)傳遞系統(tǒng),作用于視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜或鞏膜的細(xì)胞,對(duì)眼軸的生長(zhǎng)和近視的形成起著重要的作用。

近年來(lái)的研究還表明,不同質(zhì)量濃度的TGF-β不僅可抑制人胚RPE細(xì)胞的生長(zhǎng),改變RPE細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)[9],還可誘導(dǎo)人胚RPE細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并與其劑量成正相關(guān)[10]。TGF-β可使人RPE細(xì)胞中MM P-2 mRNA的表達(dá)上調(diào),直接改變MM P-T M P的平衡[8],從而改變細(xì)胞外基質(zhì)的正常代謝,且有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)TGF-β的基因表達(dá)與高度近視無(wú)關(guān)聯(lián)性[11]。可見(jiàn)TGF-β與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它既可改變細(xì)胞的形態(tài),又可影響與近視相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和細(xì)胞內(nèi)因子的分泌。

本研究成功建立了豚鼠透鏡誘導(dǎo)近視眼動(dòng)物模型,在實(shí)驗(yàn)中,我們希望通過(guò)分不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同部位(前部和后極部)觀察實(shí)驗(yàn)眼和對(duì)照眼RPE細(xì)胞TGF-β2及TGF-β2mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,揭示TGF-β與近視眼后極部眼軸延長(zhǎng)的關(guān)系。結(jié)果顯示透鏡誘導(dǎo)豚鼠近視眼RPE細(xì)胞中TGF-β2及TGF-β2mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照眼;各誘導(dǎo)時(shí)間段前部及后極部RPE細(xì)胞均有TGF-β2的表達(dá),后極部RPE細(xì)胞于6天表達(dá)較高,前部無(wú)明顯變化,前部及后極部的表達(dá)有顯著性差異;前部RPE細(xì)胞于15天表達(dá)較高,至30天時(shí),后極部表達(dá)較前部表達(dá),仍有顯著性差異。推測(cè)在透鏡誘導(dǎo)豚鼠近視眼形成過(guò)程中,RPE細(xì)胞中TGF-β2活性升高從后極部開(kāi)始,通過(guò)與下一級(jí)信使結(jié)合作用于后極部鞏膜成纖維細(xì)胞;隨著誘導(dǎo)時(shí)間推移,整體RPE細(xì)胞中TGF-β2的活性也升高,但仍以后極部為主,并穩(wěn)定于一定濃度。因此.本研究首次揭示的RPE細(xì)胞的TGF-β表達(dá)的前后差異.很可能與鞏膜的正常生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān),并進(jìn)一步與實(shí)驗(yàn)中近視的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)的調(diào)節(jié)處于一種微妙的平衡狀態(tài),透鏡誘導(dǎo)可以影響TGF-β的分泌平衡,造成豚鼠近視眼的形成和發(fā)展。

本研究由于時(shí)間有限,只對(duì)RPE細(xì)胞中TGF-β及TGF-βmRNA的表達(dá)進(jìn)行了半定量及定量研究。RPE細(xì)胞中TGF-β有陽(yáng)性表達(dá),參與豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視眼的形成,但是哪些信號(hào)使TGF-β表達(dá)發(fā)生改變,而TGF-β又是通過(guò)怎樣的途徑到達(dá)鞏膜,引起鞏膜改變的信號(hào)又是什么,抑制TGF-β的表達(dá)能否減輕近視眼眼軸延長(zhǎng),還有待于進(jìn)一步研究,另外由于時(shí)間緊迫,未對(duì)“RPE-脈絡(luò)膜級(jí)聯(lián)系統(tǒng)”[12]中的脈絡(luò)膜黑素細(xì)胞進(jìn)行研究,下一步實(shí)驗(yàn)還有待完善。

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Altered TGF-β2 expression in retinal pigment epithelial(RPE)cells from an experimentally-induced myopia guinea pig model

CHENBo-Yu,WANGChao-ying,CHENWei-yi

(1.FromtheDepartmentofOphtalmology,theBethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang,Hebei,050082;3.DepartmentofBiomechianicsResearch,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan,Shanxi,030001)

Objective To observe the expression of transforming growth factor-β2(TGF-β2)in cultured guinea pig anterior and posterior retinal pigment epithelial(RPE)cells in lens-induced myopia(LIM).Methods Three groups(n=10)of two-week-old guinea pigs were used to develop concave lens-induced myopia(LIM)in one eye via the out-of-focus method for 6,15 or 30 d,respectively,while the other eye in each guinea pig served as the self-control(SC).After myopia induction,lenses were removed,and RPE cells were cultured and passaged twice.TGF-β2 expression levels of retinal pigment epithelial(RPE)cells in LIM and SC groups were compared by immunocytochemistry,quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and Western blot analyses.All datas were statistically analyzed by SPSS 13.0 system.Results The TGF-β2 expression of the anterior portion of the RPE cells in the LIM group was significantly higher at 15 d and the highest at 30 d after myopia induction compared with the SC group(P<0.05).The TGF-β2 staining of the posterior RPE cells in the LIM group began to rise significantly at 6 d,peaked at 15 d and remained significantly higher than that of the anterior part,as well as the SC group,even at 30 d after myopia induction(P< 0.05).Conclusion During myopia development in lens-induced guinea pigs,the increase in TGF-β2 activity of RPE cells initiated at the posterior pole.Along with the induction time,the TGF-β2 activity in all RPE cells became elevated.

Guinea pig; Retinal Pigment epithelial(RPE)cells; Transforming growth factor-β2(TGF-β2); Immunocytochemistry; Real-Time PCR Analysis; Western blotting

《力學(xué)信號(hào)對(duì)實(shí)驗(yàn)性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、鞏膜成纖維細(xì)胞的影響》河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H2012505009)

1.050802,河北石家莊,白求恩國(guó)際和平醫(yī)院眼科;2.030001,山西太原,太原理工大學(xué)大學(xué)生物力學(xué)研究所

陳博宇,E-mail:chenby2190@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.04.002

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