miRNA在肝癌患者血清中的表達及意義

桂瑞豐，胡文輝

(1.黃岡市中心醫院檢驗科，湖北 黃岡　438000；

2.鄂州市中心血站質量管理科，湖北 鄂州　436000)

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miRNA在肝癌患者血清中的表達及意義

桂瑞豐1，胡文輝2

(1.黃岡市中心醫院檢驗科，湖北 黃岡438000；

2.鄂州市中心血站質量管理科，湖北 鄂州436000)

摘要：目的探討肝細胞性肝癌(HCC)患者血清中miR-27a、miR-30a、miR-106b、miR-490這四種miRNAs的表達變化及臨床意義。方法選取50例肝癌患者為研究組、50例慢性肝病患者及50例健康體檢者為對照組，應用實時熒光定量PCR法檢測各組血清四種miRNAs表達水平，并比較其與患者臨床病理特征之間的關系，應用受試者回歸(ROC)曲線分析miRNA對于肝癌診斷的價值。結果血清miR-27a、miR-30a、miR-490在HCC患者、慢性肝病患者及健康對照中表達無顯著差異(P>0.05)，HCC患者血清miR-106b表達水平較正常對照組及慢性肝病組均顯著升高(P<0.05)；血清miR-106b表達水平在不同腫瘤分化程度及臨床分期有顯著差異(P<0.05)；ROC曲線分析顯示血清miR-106b區分肝癌與慢性肝病及正常人的臨界值為0.038，曲線下面積( AUC)為0.782，診斷敏感度為0.82，特異度為0.75。結論miR-106b在肝癌患者血清中表達升高顯著，可作為肝癌診斷與預后評估的有效指標。

關鍵詞：肝細胞性肝癌；miRNA；血清水平

細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，也為肝臟最主要的惡性腫瘤，在所有癌癥中死亡率排名第三[1]。肝癌的早期癥狀不明顯，大多數肝癌患者發現時已是晚期，且其復發率較高，手術后極易復發，故肝癌患者的總體5年生存率極低[2]。近年來對于肝癌診斷的特異性標志物的研究一直是國內外的研究熱點之一，微小RNA(microRNAs, miRNAs)與腫瘤的發生發展的密切關系已被證實，其正在成為腫瘤標志物研究的新熱點[3]。現有的研究表明miR-27a、miR-30a、miR-106b與miR-490與惡性腫瘤高度相關，miR-27a與miR-30a異常表達在食管癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中[4-6]，miR-106b與miR-490在肝癌患者組織或細胞中表達異常，并與肝癌的病理學特征具有一定關系[7-8]，為了了解這四種miRNAs在HCC患者血清中的表達水平，并分析它們的在臨床應用的實際意義，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年2—12月來黃岡市中心醫院初診的50例肝癌患者為研究組，年齡25～67歲，平均年齡(51.4±12.8)歲，男32例，女18例，入組標準：知情同意，首次確診為HCC，未接受任何手術、化療、放療治療，并排除既往有腫瘤病史患者；選取同期來我院就診的50例慢性乙肝或慢性乙肝所致肝硬化患者為慢性肝病對照組，其中男35例，女15例，年齡(54.3±11.7)歲；選取同期來我院體檢中心進行健康體檢的健康成年人為健康對照組，其中男34例，女16例，年齡(52.7±12.4)歲，各組的一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及Real-Time PCR(SYBR Green)試劑盒均購自上海羅氏公司，miR-27a、miR-30a、miR-106b、miR-490及內參miR-16引物均由上海生工設計合成。熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司 ABI 7500 Real time PCR儀。

1.3實驗方法

1.3.1血清標本的采集與保存采集患者及健康對照靜脈血標本3～5 mL，排除黃疸、脂濁及溶血標本，常溫靜置30 min，待其充分凝結析出血清后4℃下3 000 r·min-1離心20 min，吸出上清液4℃下16 000 r·min-1離心10 min，小心吸取上清血清放入無RNA酶的1.5 mL EP管中-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2總RNA的提取將血清標本于超低溫冰箱中取出并迅速置于37℃水浴中解凍，取200 μL血清按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，與RNA保存液置于無RNA酶的1 mL EP管中，立即進行逆轉錄PCR。

1.3.3逆轉錄PCR按照逆轉錄試劑盒說明進行操作，由于miRNA分子較短，故選用加尾法逆轉錄，并在無RNA酶的PCR管中進行PCR反應，反應結束后將獲得的cDNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3.4熒光定量PCR按照Real-Time PCR(SYBR Green)檢測試劑盒說明書操作，反應體系20 μL，反應條件95℃15 s，55℃30 s，70℃34 s，共40循環，并于70℃時采集熒光信號，反應重復三次取平均值為最終結果。

1.3.5結果判定記錄反應Ct值，以miR-16為定量參照，以2-△Ct表示各miRNA的相對表達，△Ct= CtmiRNA-CtmiR-16。

1.4統計學分析應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，miRNA的相對表達量用中位數(四分位數)表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。此外，受試者回歸曲線(Receiver operating characteristics，ROC)分析使用SAS 6.12軟件進行。顯著性水準α=0.05。

2結果

2.1miRNAs的表達情況熒光定量PCR反應擴增曲線見圖1，研究組、慢性肝病對照組及健康對照組的各miRNA相對表達情況見表1。miR-27a、miR-30a與miR-490的相對表達量各組間無顯著差異(P>0.05)，研究組miR-106b相對表達量顯著大于健康對照組(P<0.05)，而慢性肝病對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2HCC患者血清miRNA表達水平與臨床病理特征的關系HCC患者的miR-27a、miR-30a與miR-490的血清相對表達量在患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度以及TNM分期中的比較差異無統計學意義(P>0.05)，miR-106b在HCC患者臨床病理特征中的不同表達見表2，miR-106b在年齡、性別、腫瘤直徑上表達無顯著差異(P>0.05)，腫瘤細胞分化程度低的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于分化程度高、中的患者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ/Ⅳ的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。

圖1　部分樣本的熒光定量PCR反應擴增曲線

miRNA研究組慢性肝病對照組健康對照組miR-27a1.362(0.967,1.758)1.181(0.875,1.363)1.056(0.789,1.341)miR-30a0.742(0.647,0.975)0.841(0.712,0.983)0.973(0.773,1.148)miR-106b0.051(0.034,0.091)*0.024(0.015,0.043)0.021(0.012,0.041)miR-4900.062(0.047,0.081)0.071(0.052,0.085)0.074(0.057,0.088)

注：與健康對照相比，*P<0.05。

表2　 miR-106b的表達與臨床病理特征的關系

2.3血清miR-106b的診斷價值用血清miR-106b的相對表達作為標志物用于區分HCC患者與慢性肝病患者及健康對照，綜合特異度與靈敏度選擇兩者之和最大截斷點(Cut-off)為臨界值，結果表明：臨界值為0.038，敏感度為0.82，特異度為0.75，曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.782(95%CI：0.658～0.871，P<0.01)。用該臨界值對慢性肝病患者及HCC患者進行鑒別診斷的結果見表3，敏感度為0.80，特異度為0.72。

表3　血清miR-106b對HCC的診斷結果/例

3討論

miRNA是一類內源性的小分子非編碼RNA，具有高度的穩定性，在mRNA 水平調節靶基因的表達，參與調控有機體的生命活動并在細胞各項正常生命活動及包括腫瘤在內的各種疾病的發生發展中發揮重要調節作用，近年來由于其與癌癥等疾病的良好關聯性，使其成為對各類癌癥具有潛在臨床診療價值的腫瘤標志物的新選擇[9]。本研究根據這一原理，分析了4個miRNAs在HCC患者、慢性肝病患者和健康人對照血清中的表達，研究這幾種miRNAs與HCC臨床病理參數之間的關系以及對 HCC 的診斷價值。

miR-27a與miR-30a已被證實與前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤密切相關。在乳腺癌，miR-27a通過間接促進血管內皮生長因子(VEGF)等促進腫瘤轉移的存活素的表達來促進腫瘤的生長、轉移，miR-27a在乳腺浸潤性癌中高表達，且高表達miR-27a的乳腺癌患者預后較差，5年生存率較低[10]。在前列腺癌中，miR-30a可通過影響肝細胞生長因子與EGF(表皮生長因子)等致癌因子的表達來抑制上皮間質轉化，發揮抑制腫瘤的作用[11]。而在本研究中，miR-27a與miR-30a在HCC患者、慢性肝病患者及健康對照血清中表達無顯著差異(P>0.05)，它們在HCC發生發展中的意義尚待進一步大樣本的研究考證。miR-490被認為可能為一種抑癌基因，并在結直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤中低表達[12]，但在肝癌患者組織中表達上調[8]，但本研究在HCC患者、慢性肝病患者及健康對照血清中未發現miR-490的表達差異(P>0.05)，其與HCC的關系尚待進一步研究。

miR-106b是miR-106b～25簇的組成部分，位于人第7號染色體長臂上，miR-106b與腫瘤的密切聯系已在多種腫瘤中被證實，其表達的升高與腫瘤的惡性程度正相關，如前列腺癌、胃癌等[13-14]。在肝癌中，miR-106b被證實在肝癌組織中表達升高，并且在高轉移細胞系中顯著升高[7]。在本研究中，血清miR-106b的表達水平在HCC患者中較慢性肝病與健康對照顯著升高，且HCC患者的miR-106b血清表達水平在不同腫瘤細胞分化程度、TNM分期顯著不同，腫瘤細胞分化程度低的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于分化程度高、中的患者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ/Ⅳ的患者的血清miR-106b相對表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)，提示miR-106b在鑒別HCC患者的臨床病理參數、腫瘤惡性程度及術前病情評估上有廣闊的應用前景。

在用miR-106b作為標志物對HCC患者、慢性肝病患者及健康對照進行診斷的研究中，ROC曲線分析顯示，最佳臨界值為0.038，敏感度為0.82，特異度為0.75，具有較高的診斷價值，且其在對區分慢性肝病與HCC上仍有較高的敏感度與特異度，提示其對肝癌早期診斷有著潛在的篩查價值，可用于對慢性肝炎及肝硬化患者等肝癌高危人群的篩查診斷。

參考文獻：

[1]鐘文洲,陳正義,王齊全.原發性肝癌發病危險因素的病例對照分析[J].安徽醫藥,2014,18(2):275-277.

[2]Schwartz M,Roayaie S,Konstadoulakis M. Strategies for the management of hepatocellular carcinoma[J].Nature Clinical Practice Oncology,2007,4(7):424-432.

[3]陳勝,王亮,曹爽,等.外周血中microRNA用于肝癌診斷的研究進展[J]. 國際消化病雜志,2014,34(6):389-391.

[4]Tang W,Zhu J,Su S,et al. MiR-27 as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J]. PLoS One,2012,7(12):e51702.

[5]Kao CJ,Martiniez A,Shi XB,et al.miR-30a as a tumor suppressor connects EGF/Src signal to ERG and EMT[J].Oncogene,2014,33(19):2495-2503.

[6]Markou A,Sourviou I,Vorkas PA,et al.Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2013,81(3): 88-96.

[7]Yau WL, Lam CS,Ng L,et al. Over-expression of miR-106b promotes cell migration and metastasis in hepatocellular carcinoma by activating epithelial-mesenchymal transition process[J].PloS One, 2013,8(3):e57882.

[8]Zhang LY, Liu M, Li X, et al. miR-490-3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3 (ERGIC3)[J].The Journal of Biological Chemistry,2013,288(6):4035-4047.

[9]Markou A,Sourvinou I,Vorkas PA,et al. Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2013,81(3): 88-96．

[10] Tang W,Zhu J,Su S,et al. MiR-27 as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J]. PLoS One, 2012,7(12):e51702.

[11] Kao CJ,Martiniez A,Shi XB,et al. miR-30a as a tumor suppressor connects EGF/Src signal to ERG and EMT[J].Oncogene, 2014, 33(19): 2495-2503.

[12] Hamfjord J,Stangeland AM, Hughes T, et al. Differential expression of miRNAs in colorectal cancer: comparison of paired tumor tissue and adjacent normal mucosa using high-throughput sequencing[J]. PloS One,2012,7(4):e34150.

[13] Yao YL,Wu XY,Wu JH,et al. Effects of microRNA-106 on proliferation of gastric cancer cell through regulating p21 and E2F5[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention:APJCP,2013,14(5):2839-2843.

[14] Hudson RS,Yi M,Esposito D,et al. MicroRNA-106b-25 cluster expression is associated with early disease recurrence and targets caspase-7 and focal adhesion in human prostate cancer[J]. Oncogene,2013,32(35):4139-4147.

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本刊法定計量單位實行國務院1984年2月頒布的《中華人民共和國法定計量單位》，并以單位符號表示，具體使用參照1991年中華醫學會編輯出版部編輯的《法定計量單位在醫學上的應用》一書。注意單位名稱與單位符號不可混合使用，如ng·kg-1·天-1應改為ng·kg-1·min-1；組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時，應采用負數冪的形式表示，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式；組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現不常用的法定計量單位處用括號加注與舊制單位的換算系數，下文再出現時只列法定計量單位。人體及動物體內的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現時用括號加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時間的表達，凡前面帶有具體數據者應采用d、h、min、s，而不用天、小時、分鐘、秒。量的符號一律用斜體字母，如吸光度(舊稱光密度)的符號為A,“A”為斜體字。

收稿日期：(2015-09-20，修回日期：2015-11-17)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.037