超聲輔助響應面法優(yōu)化巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷共同提取工藝研究

張建海　馮彬彬　牛小花

摘要：目的 應用響應面法優(yōu)化巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的超聲輔助提取工藝。方法 在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計和響應面分析法考察乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間、液固比對巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷含量的影響。結果 最佳超聲輔助提取工藝為乙醇體積分數(shù)73%、超聲提取時間22 min、料液比為1∶32，巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷得率分別為（15.90±0.12）%和（0.75±0.05）%。結論 本研究所建立的提取工藝能夠提高巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的提取率，與模型預測值相符。

關鍵詞：巫山淫羊藿；朝藿定C；淫羊藿苷；超聲輔助提取；響應面法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.023

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0085-04

Abstract： Objective To optimize ultrasonic-assisted extraction Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba by response surface methodology. Methods On the basis of single factor tests， Box-Behnken experimental design and response surface methodology were adopted to optimize extraction conditions with the concentration of ethanol， ultrasonic time and solid-liquid ratio as factors. HPLC was used to determine the content of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba. Results Optimal ultrasound-assisted extraction technology was as following： the concentration of ethanol was 73%； the ultrasonic time was 22 min； the ratio of liquid to material was 1：32. The contents of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba were 15.90% and 0.75%， respectively. Conclusion This extraction technology can improve the extraction efficiency of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba， which is in accordance with predicted value.

Key words： Epimedii Wushanensis Herba； Epimedin C； Icariin； ultrasound-assisted extraction； response surface method

巫山淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying的干燥葉，具有補腎陽、強筋骨等功效。巫山淫羊藿中的主要活性成分是淫羊藿苷、朝藿定C，其中朝藿定C的含量較高，因此巫山淫羊藿有區(qū)別于其他淫羊藿的藥效特性[1-4]。2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）將其單列，表明巫山淫羊藿有其獨特之處。近年來，我國學者就淫羊藿的主要成分提取工藝開展了很多研究工作[1-2，4]，但迄今對巫山淫羊藿的研究較少。超聲波輔助提取法是利用超聲波產生的強烈振動、高加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等，加速有效成分進入溶劑，從而提高浸出率，縮短提取時間，具有操作方便、品質穩(wěn)定等優(yōu)點[5-8]。為了進一步優(yōu)化巫山淫羊藿提取工藝，根據(jù)有關文獻和預試驗結果[2，9-12]，本研究采用乙醇作為溶劑，結合超聲波輔助提取巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷，并通過Box-Behnken試驗和響應面分析法優(yōu)選提取工藝，為巫山淫羊藿的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國Agilent1260智能柱溫箱及VWD紫外檢測器；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DGX-9143B-1型數(shù)顯鼓風干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司；HH.SYZ1-NI型電熱恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表公司；SHB-IV雙A循環(huán)式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；Millipore純水系統(tǒng)。

朝藿定C、淫羊藿苷對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111780-200801、110737-200415）；乙醇、甲醇等均為分析純，乙腈、甲醇為色譜純；水為去離子水，其他試劑均為分析純。巫山淫羊藿，采集野生植物，經西南大學王海洋教授鑒定為小檗科淫羊藿屬植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S. Ying的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 朝藿定C和淫羊藿苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈和水，采用梯度洗脫（乙腈：0～10 min，20%；10～20 min，45%；20～25 min，55%；25～30 min，20%），流速為1.0 mL/min，溫度25 ℃，檢測波長270 nm，進樣量20 μL[10-12]。

2.1.2 標準曲線的建立 取朝藿定C和淫羊藿苷對照品10 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加乙醇溶解，得朝藿定C和淫羊藿苷儲備液，將朝藿定C和淫羊藿苷儲備液配制成質量濃度均為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/L的系列標準溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分析，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，得朝藿定C回歸方程Y=52.90X+82.25（r2=0.999 1），淫羊藿苷回歸方程Y=22.37X+28.37（r2=0.999 6），朝藿定C和淫羊藿苷線性范圍均為6.25～200.00 mg/L。

2.1.3 樣品測定 將巫山淫羊藿葉片清洗、陰干、粉碎、過篩（孔徑0.355 mm），在60 ℃干燥4 h。稱取各試驗設計的恒重后的巫山淫羊藿粉末0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，按照設計的試驗條件進行提取，過濾，濾液過微孔濾膜，即得樣品溶液，進樣。

2.2 單因素試驗考察

2.2.1 乙醇體積分數(shù) 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定超聲時間20 min，提取溫度50 ℃，料液比1∶30，分別用體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結果朝藿定C含量分別為（1.25±0.24）%、（1.34±0.45）%、（1.42±1.03）%、（1.46±0.67）%、（1.50±0.56）%、（1.49±0.94）%、（1.37±1.34）%，淫羊藿苷含量分別為（0.42±0.23）%、（0.48±1.07）%、（0.54±0.37）%、（0.68±0.62）%、（0.71±0.71）%、（0.67±0.92）%、（0.65±1.18）%，故綜合考慮選擇70%乙醇。

2.2.2 超聲時間 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分數(shù)70%，提取溫度50 ℃，料液比1∶30，分別超聲提取10、15、20、25、30、35、40 min，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結果朝藿定C的含量分別為（1.32±0.57）%、（1.43±1.95）%、（1.52±0.75）%、（1.50±0.08）%、（1.48±0.24）%、（1.47±0.14）%、（1.45±0.46）%，淫羊藿苷含量分別為（0.57±1.04）%、（0.63±0.73）%、（0.70±0.26）%、（0.68±0.73）%、（0.66±0.26）%、（0.65±0.87）%、（0.67±0.21）%，故綜合考慮選擇超聲提取20 min。

2.2.3 提取溫度 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分數(shù)70%，超聲提取時間20 min，料液比1∶30，分別于30、40、50、60、70、80 ℃進行提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結果朝藿定C含量分別為（1.42±0.25）%、（1.44±0.31）%、（1.49±0.58）%、（1.47±0.29）%、（1.48±0.27）%、（1.51±0.81）%，淫羊藿苷的含量分別為（0.62±1.01）%、（0.65±0.82）%、（0.68±0.54）%、（0.68±0.37）%、（0.65±0.64）%、（0.63±0.71）%，說明提取溫度對朝藿定C的提取率影響不大，故綜合考慮選擇提取溫度為50 ℃。

2.2.4 料液比 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分數(shù)70%，超聲提取時間20 min，超聲溫度為50 ℃，料液比（g/mL）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40進行提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結果朝藿定C含量分別為（1.38±0.25）%、（1.41±0.78）%、（1.45±0.92）%、（1.48±0.17）%、（1.51±0.11）%、（1.50±0.28）%、（1.41±0.15）%，淫羊藿苷的含量分別為（0.48±0.28）%、（0.52±0.09）%、（0.58±0.17）%、（0.64±0.47）%、（0.69±0.28）%、（0.67±0.17）%、（0.65±0.58）%，故綜合考慮選擇料液比為1∶30。

2.3 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗考察的結果，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗設計，以乙醇濃度、超聲時間、料液比為自變量，以朝藿定C和淫羊藿苷的得率為因變量，研究響應值及最佳變量的組合。試驗因素水平見表1。共設計17個試驗，重復3次。根據(jù)響應面試驗，按照“2.1”項下方法測定朝藿定C和淫羊藿苷含量，試驗安排及結果見表2，響應面分析見圖1，方差分析結果見表3。

從表3方差分析可知，對朝藿定C來說，B、C、A2、B2、C2為顯著影響因素；在各影響因素中，超聲時間（B）的影響最大，其次是料液比（C）、乙醇濃度（A）；在總的作用因素中，1次項和平方項的影響較大，而交互項影響相對較小。對淫羊藿苷來說，C、AB、AC、BC、A2、B2、C2為顯著影響因素；在各影響因素中，料液比（C）的影響最大，其次是乙醇濃度（A）、超聲時間（B）；在總的作用因素中，交互項和平方項的影響較大，而1次項影響相對較小，乙醇濃度和超聲時間、乙醇濃度和料液比、超聲時間和料液比均具有交互作用。

以朝藿定C和淫羊藿苷提取量為響應值，采用Design-Expert軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行三元二次多項式逐步回歸擬合，得回歸方程Y=1.608+0.0025A+0.08125B+0.06125C-0.0175AB-0.0425AC+0.0150BC-0.0965A2-0.1390B2-0.0990C2、Y=0.7460+0.0200A+0.0175B+0.0275C-0.0500AB-0.0350AC-0.0300BC-0.0855A2-0.0705B2-0.0805C2。由表3可知，該模型高度顯著，失擬項相對于絕對誤差不顯著。模型確定系數(shù)（R2）為0.993 7，說明此模型與實際試驗擬合較好，能很好地描述試驗結果。圖1響應面分析更為直觀地表現(xiàn)了各因素與朝藿定C和淫羊藿苷提取量的相互關系，表明各因素對朝藿定C交互作用不顯著，而對淫羊藿苷含量交互作用顯著。

2.4 驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應面設計優(yōu)化，確定朝藿定C的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)76.24%、提取時間22.64 min、料液比1∶31.95 g/mL，朝藿定C理論提取量為1.58%；淫羊藿苷的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)70%、提取時間21.14 min、料液比1∶31.51 g/mL，淫羊藿苷理論提取量為0.75%。結合實際操作考慮，將工藝條件修正為乙醇體積分數(shù)73%、提取時間22 min、料液比1∶32 g/mL。按該工藝進行5次驗證試驗，結果巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷提取量分別為（15.90±0.12）%和（0.75±0.05）%，與預測值基本一致，表明該三元二次方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性。

3 討論

超聲波提取方法可較好地用于巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷有效成分的提取，其主要藥效成分可較好保留。在整個提取過程中溫度較低，有利于巫山淫羊藿中的有效成分不被破壞。

本研究在單因素試驗基礎上，確定乙醇體積分數(shù)、提取溫度、液固比對巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷提取率影響顯著，采用響應面法對超聲輔助提取的工藝條件進行優(yōu)化，結果預測值與實測值基本一致，說明建立的工藝條件可靠，能有效提高巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的提取率，對巫山淫羊藿資源的綜合利用及工業(yè)化生產具有指導意義。

本研究采用響應面法優(yōu)化了提取巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的4個關鍵因子，得到二次項回歸模型，并對交互項作用進行分析。確定最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)73%，提取時間22 min，料液比1∶32 g/mL。

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（收稿日期：2015-05-07）

（修回日期：2015-06-01；編輯：陳靜）