電針肝俞、足三里對抑郁型功能性消化不良大鼠腦腸相互作用的研究

姜開妍　李海波　張可　郭曉葦　任路

摘要：目的 觀察電針“肝俞”“足三里”對抑郁型功能性消化不良大鼠抑郁狀態、胃腸動力及腦內相關蛋白表達的影響，探討電針治療抑郁型功能性消化不良的機制。方法 將48只雌性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、電針組和非穴組，每組12只。應用慢性不可預見性溫和應激法建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型。于造模第15日開始，電針組每日予電針“肝俞”“足三里”干預，非穴組給予距尾尖1/3、2/3處電針刺激，干預14 d。于實驗前1 d和實驗第14、28日對各組大鼠進行體質量檢測、曠場實驗和蔗糖偏好實驗；于取材前對各組大鼠進行黑色糊狀物灌胃，40 min后檢測大鼠胃內殘留率和小腸推進率；Western blot檢測大鼠外側韁核βCaMKⅡ、海馬腦源性神經營養因子（BDNF）蛋白的表達。結果 與空白組比較，模型組和非穴組大鼠體質量、蔗糖偏好率、行為學評分、小腸推進率、海馬BDNF表達明顯下降（P<0.01），胃內殘留率和外側韁核βCaMKⅡ表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針組大鼠體質量、蔗糖偏好率、行為學評分、小腸推進率、海馬BDNF表達明顯升高（P<0.01），胃內殘留率和外側韁核βCaMKⅡ表達明顯降低（P<0.01）；與非穴組比較，電針組大鼠外側韁核βCaMKⅡ表達量顯著降低、海馬組織BDNF表達量顯著增加（P<0.01）。結論 電針“肝俞”“足三里”可改善抑郁型功能性消化不良大鼠的抑郁狀態和胃腸動力。

關鍵詞：抑郁型功能性消化不良；電針；肝俞；足三里；βCaMKⅡ；腦源性神經營養因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.017

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0062-05

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture at Ganshu （BL18） and Zusanli （ST36） on depression state and gastrointestinal motility and relevant protein expressions in brain of rats with stress-induced depressive functional dyspepsia. Methods Totally 48 Wistar rats were randomly divided into normal， model， electroacupuncture （EA） and sham-operation group， with 12 rats in each group. Depressive functional dyspepsia model was established by chronic unpredictable mild stress protocols. From day 15 to day 28， the EA group was given electroacupuncture at BL18 and ST36， and the sham-operation group was stimulated by electroacupuncture at 1/3 and 2/3 of the tail. Body weight test， open field test and sucrose preference test were measured on day 0， day 14 and day 28. After 14-day administration， gastric residual volume and intestinal propulsion rate of semisolid paste were detected. The expression of βCaMKⅡin lateral habenulas and BDNF in hippocampus were measured by Western blot. Results Compared with the normal group， the weight， the sucrose preference rate， the behavior score， the small intestinal propulsion rate of semisolid paste and the expression of BDNF in hippocampus decreased significantly both in the model group and sham-operation group （P<0.01）， and the gastric residual volume of semisolid paste and the expression of βCaMKⅡin lateral habenulas increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the weight， the sucrose preference rate， the behavior score， the small intestinal propulsion rate of semisolid paste and the expression of BDNF in hippocampus increased significantly in EA group （P<0.01）， and the gastric residual volume of semisolid paste and the expression of βCaMKⅡin lateral habenulas decreased significantly （P<0.01）. Compared with the sham-operation group， the expression of βCaMKⅡ in lateral habenulas decreased significantly， the expression of BDNF in hippocampus increased significantly in EA group （P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture at Ganshu （BL18） and Zusanli （ST36） can improve depression and gastrointestinal motility of rats with depressive functional dyspepsia， which may be related to the inhibition of βCaMKⅡin lateral habenulas and the activation of BDNF in hippocampus dyspepsia.

Key words： depressive functional dyspepsia； electroacupuncture； Ganshu （BL18）； Zusanli （ST36）； βCaMKⅡ； BDNF； rats

功能性消化不良是一種常見的慢性非器質性胃腸功能紊亂性疾病，臨床表現主要為噯氣、厭食、腹脹、腹痛等。目前，西藥治療多采用促進胃動力藥物，雖然能有效緩解癥狀，但具有較高的復發率，并且有部分患者對藥物治療無效，給患者生活質量帶來明顯的影響。本實驗通過模擬人類每日應激引起抑郁狀態和胃腸不適的方法，建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型，觀察電針對模型大鼠的抑郁狀態及胃腸動力的影響，檢測外側韁核βCaMKⅡ及海馬腦源性神經營養因子（BDNF）蛋白的表達，探討電針對抑郁型功能性消化不良的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

7～8周齡SPF級雌性Wistar大鼠48只，體質量180～210 g，遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK（遼）2010-0001。動物飼養于遼寧中醫藥大學動物實驗中心屏障環境。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉（北京鼎國昌盛生物技術有限公司），βCaMKⅡ一抗（Santa，C-20），BDNF一抗（Santa，N-20），β-actin一抗（Santa，C-4），羊抗鼠二抗（Santa，sc-2005），羊抗兔二抗（Santa，sc-2004），兔抗羊二抗（Santa，sc-2768）。電針儀（6805D，廣州汕頭市醫用設備廠），華佗牌一次性無菌針灸針（0.25 mm×13 mm），自制曠場箱（100 cm×100 cm×40 cm），恒溫振蕩器（國華企業，SHA-C），高通量組織研磨儀（Thmorgan，CK1000D），臺式高速冷凍離心機（Heal Force，Neofuge 13R），酶標儀（BIO-RAD，iMark），穩壓穩流電泳儀（Tanon，EPS300）。

1.3 分組及造模

大鼠適應性飼養7 d后，經曠場實驗測定，48只成年大鼠曠場評分相近，將其隨機分為空白組、模型組、電針組和非穴組，每組12只。采用慢性不可預見性溫和應激（CUMS）法[1]建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型。除空白組外，其余各組大鼠在4周內每日以2～3次的頻率交替接受以下刺激：禁食24 h、禁水24 h、熱刺激5 min、冷刺激5 min、濕籠24 h、置于空籠24 h、傾斜籠45°24 h、噪音刺激2 min、明暗顛倒24 h、夾尾3 min。相鄰2 d不施以同種刺激。

1.4 干預措施

從造模第3周開始對各組施以相應干預措施。模型組給予抓取固定刺激，電針組大鼠進行電針治療。安靜環境中，將大鼠軀干固定于自制木板上，選擇6805D型電針儀，疏密波型，疏波4 Hz，密波20 Hz，強度以局部肌肉輕微顫動為度，每次15 min，每日1次，連續干預14 d。穴位定位參照《實驗針灸學》[1]，并參考比較解剖學和模擬人體經穴定位法進行大鼠穴位定位。“肝俞”位于大鼠第9胸椎下兩旁肋間，旁開約5 mm，左右兩側各1穴，直刺6 mm；“足三里”位于膝關節下方，腓骨小頭下緣約5 mm處，左右兩側各1穴，直刺5 mm。非穴位組大鼠進行非穴位電針干預，在距離大鼠尾尖1/3、2/3處給予電針刺激[2]，其余條件同電針組。

1.5 檢測指標

1.5.1 體質量檢測 分別于實驗前1 d和實驗第14、28日測量大鼠體質量，以此來衡量大鼠是否出現類似于人類的食欲不振、體質量降低等抑郁型功能性消化不良的癥狀。

1.5.2 行為學檢測 分別于實驗前1 d和實驗第14、28日對大鼠進行行為學檢測，包括曠場實驗、蔗糖偏好實驗，作為評價造模成功與否及干預效果的行為學參照。

1.5.2.1 曠場實驗 在安靜的實驗室，對大鼠進行單只觀察，將大鼠置于100 cm×100 cm×40 cm四周涂黑的無蓋木制方箱，方箱底面劃分成20 cm×20 cm的25個方格。每只大鼠被放置在場箱最中央的方格中，觀察記錄其3 min內的活動。評分標準：大鼠水平穿越方格數以四肢全部跨入鄰格為1格，爬行1格記水平得1分；大鼠前肢全部離開水平地面，僅后爪著地為站立，自大鼠前肢全部離開地面至四肢著地為站立1次，站立1次記垂直得1分。

1.5.2.2 蔗糖偏好實驗 參照文獻[3]，在該實驗前訓練大鼠適應飲用蔗糖水，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h，2瓶均裝有1%蔗糖水，第2個24 h，1瓶為1%蔗糖水，1瓶為滅菌水。正式檢測時，大鼠禁食禁水24 h后同時給予每只大鼠事先稱好質量的1%蔗糖水和滅菌水各1瓶。30 min更換位置，1 h后取走水瓶進行稱量，計算每只大鼠蔗糖偏好率[糖水消耗量÷（糖水消耗量+滅菌水消耗量）×100%]。

1.5.3 小腸推進率及胃內殘留率檢測 半固體營養糊的制備[4]：5 g羧甲基纖維素鈉溶于125 mL蒸餾水中，再分別加8 g奶粉、4 g白糖、4 g淀粉和2 g活性炭末，一邊攪拌一邊再加蒸餾水配制成150 mL黑色半固體糊狀物（約1 g/mL）。大鼠取材前給予半固體糊狀物2 mL灌胃，40 min后10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，將胃賁門和幽門部結扎，取胃，稱量胃全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內殘留物后將水擦干，稱量胃凈重。胃全重與胃凈重之差即為胃內殘留物質量，計算胃內殘留率（胃內殘留物質量÷所灌胃黑色半固體糊狀物質量×100%）。同時分離腸系膜，剪取幽門至回盲部的腸管，置于白紙上，輕輕拉成直線，測量腸管長度為小腸總長度，從幽門至黑色半固體糊狀物前沿的距離為其在小腸內推進的距離，計算小腸推進率（糊狀物在小腸推進的距離÷小腸總長度×100%）[5]。

1.5.4 Western blot檢測外側韁核βCaMKⅡ及海馬腦源性神經營養因子蛋白表達 在冰上迅速剝離大鼠大腦，分離出海馬和外側韁核部位。提取大鼠海馬與外側韁核部位蛋白，BCA法進行蛋白定量。各取50 μg蛋白，加上樣緩沖液后煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白濕轉至NC膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加一抗（稀釋比例均為1∶200），4 ℃過夜，用TBST洗膜5次，每次5 min。加相應二抗（按1∶5000稀釋），室溫孵育2 h，TBST洗膜5次×5 min。經ECL顯色，暗室曝光得到X光膠片。應用Image J圖像分析軟件分析光密度值。采用目的蛋白與內參蛋白條帶光密度值的比值作為結果進行分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.01表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對大鼠體質量的影響

實驗第14日與空白組比較，其余各組大鼠體質量下降（P<0.01）；實驗第28日電針組大鼠體質量顯著高于模型組（P<0.01），而非穴組大鼠體質量與模型組相近（P>0.05）；電針組體質量顯著高于非穴組（P<0.01）。結果見表1。

2.2 電針對大鼠曠場實驗水平得分的影響

實驗第14日與空白組比較，其余各組大鼠水平得分均顯著降低（P<0.01）；實驗第28日與空白組比較，模型組大鼠水平得分顯著降低（P<0.01），電針組大鼠水平得分顯著高于模型組（P<0.01），電針組水平得分顯著高于非穴組（P<0.01）。結果見表2。

2.3 電針對大鼠曠場實驗垂直得分的影響

實驗第14日與空白組比較，其余各組大鼠垂直得分均顯著降低（P<0.01）；實驗第28日與空白組比較，模型組和非穴組大鼠垂直得分顯著降低（P<0.01），電針組大鼠垂直得分顯著高于模型組（P<0.01），電針組垂直得分顯著高于非穴組（P<0.01）。結果見表3。

2.4 電針對大鼠蔗糖偏好率的影響

實驗第14日與空白組比較，其余各組大鼠蔗糖偏好率均明顯下降（P<0.01）；實驗第28日與空白組比較，模型組和非穴組大鼠蔗糖偏好率均明顯下降（P<0.01），電針組大鼠蔗糖偏好率顯著高于模型組（P<0.01），電針組蔗糖偏好率顯著高于非穴組（P<0.01）。結果見表4。

2.5 電針對大鼠胃內殘留率及小腸推進率的影響

模型組和非穴組大鼠胃內殘留率明顯高于空白組（P<0.01）；電針組胃內殘留率與模型組比較顯著降低（P<0.01）；電針組大鼠胃內殘留率顯著低于非穴組（P<0.01）；模型組與非穴組大鼠胃內殘留率無明顯差異（P>0.05）。模型組和非穴位組大鼠小腸推進率明顯低于空白組（P<0.01）；電針組小腸推進率明顯高于模型組（P<0.01）；電針組大鼠小腸推進率顯著高于非穴組（P<0.01）；模型組與非穴組大鼠小腸推進率無明顯差異（P>0.05）。結果見表5。

2.6 電針對大鼠外側韁核βCaMKⅡ和海馬腦源性神經營養因子表達的影響

各組大鼠外側韁核組織βCaMKⅡ和海馬組織BDNF的表達均以β-actin作為內參。與空白組比較，模型組和非穴組大鼠外側韁核組織βCaMKⅡ的表達量明顯增多、海馬組織BDNF表達量顯著減少（P<0.01）；與模型組比較，電針組大鼠外側韁核組織βCaMKⅡ表達量顯著降低、海馬組織BDNF表達量顯著增加（P<0.01）；與非穴組比較，電針組大鼠外側韁核βCaMKⅡ表達量顯著降低、海馬組織BDNF表達量顯著增加（P<0.01）。結果見圖1、表6。

3 討論

功能性消化不良屬中醫“痞滿”“胃脘痛”等范疇，病變臟腑在肝、脾、胃。中醫認為情志不遂、憂思惱怒、肝郁氣滯是功能性消化不良發病的主要機制之一。若怒氣傷肝，肝失疏泄，而致肝郁氣滯，肝木克脾土，影響脾胃升降功能，則中焦氣機壅滯，升降失常，形成痞滿，發生功能性消化不良?？梢?，情志與功能性消化不良的發生有著密切的關系。而臨床上抑郁癥患者常伴隨有身體不適感，其中上腹部不適為主要癥狀之一。表明抑郁狀態與功能性消化不良的發生有著密切的聯系。肝主疏泄、主情志，肝俞作為肝臟的背俞穴，可調控全身氣機；足三里屬多氣多血的足陽明胃經，與肝俞相配可更好地發揮疏肝解郁、調和脾胃的功效。

臨床調查發現功能性消化不良患者普遍存在焦慮、抑郁情緒[6]。而胃部不適也是許多抑郁癥患者首診的主要不適癥狀之一[7]。有研究表明，采用抗抑郁藥物治療功能性消化不良，能有效改善精神和軀體兩方面癥狀[8-9]。由此可見，功能性消化不良與抑郁的發生密切相關?，F代研究表明，針刺足三里對胃的運動及分泌功能有明顯的調整作用，能使原來處于緊張或收縮亢進的胃運動減弱，使原來處于弛緩狀態或較低興奮狀態的胃運動增強。對正常人針刺足三里，多數可使胃蠕動加強。并有研究表明，電針足三里可改善抑郁癥大鼠的異常行為[10]。

從體質量變化和曠場實驗結果可以看出，在造模第14日，與空白組比較，其余3組大鼠體質量、水平和垂直得分明顯減少，說明大鼠在新奇環境中自主行為、探究行為有所減少，體質量增長的減少說明模型大鼠出現了類似功能性消化不良患者食欲減退、體質量減輕的癥狀。經電針治療后，大鼠體質量、水平和垂直得分較模型組、非穴組增加，說明電針“肝俞”“足三里”可改善模型大鼠的行為狀態。蔗糖偏好實驗是根據動物對甜味的偏好而設計的一種檢測方法，當大鼠出現抑郁樣行為時，對獎賞的反應性也下降，表現為對蔗糖的偏嗜度降低，此結果反映了抑郁癥的核心癥狀——快感缺失，即是體驗快樂的能力下降。結果顯示，模型組大鼠糖水偏好率明顯低于空白組，說明模型大鼠發生了快感缺失，經過電針的干預，蔗糖偏好率有所恢復，說明電針對抑郁的快感缺失癥狀有治療作用。

胃腸動力異常是功能性消化不良病理生理機制中主要的研究主題之一，一半以上的功能性消化不良患者有胃腸動力異常的癥狀，如胃排空異常、胃竇動力低下、十二指腸動力改變等。本實驗通過對大鼠胃內殘留率及小腸推進率的測量檢驗CUMS法對大鼠胃腸動力的影響，從而綜合判斷抑郁型功能性消化不良模型建立成功與否。結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃內殘留率增高，小腸推進率降低，說明模型大鼠的胃腸運動減緩，發生異常。這與臨床抑郁癥患者多伴有功能性消化疾病相似，抑郁型功能性消化不良大鼠模型建立成功。

外側韁核屬于上丘腦的一部分。它位于海馬下方、丘腦上方，是連接前腦邊緣系統和中腦單胺中心的核心樞紐。研究發現，外側韁核的βCaMKⅡ介導了抑郁的發生，在天生抑郁大鼠的外側韁核中，研究人員抑制βCaMKⅡ的表達后大鼠的抑郁狀態改善。而外側韁核的激活能夠抑制海馬組織的活性，在抑郁患者和抑郁小鼠均發現海馬BDNF的含量表達下降[12-13]。本實驗結果顯示，CUMS模型大鼠外側韁核βCaMKⅡ表達升高，海馬BDNF表達降低。而電針肝俞、足三里能通過降低外側韁核βCaMKⅡ的活性，激活海馬內BDNF，從而改善抑郁狀態。

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（收稿日期：2015-05-10）

（修回日期：2015-06-30；編輯：華強）