牛奶中β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙的研究

施春煜

（鄭州市第十一中學，河南鄭州 450002）

牛奶中β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙的研究

施春煜

（鄭州市第十一中學，河南鄭州 450002）

青霉素經β-內酰胺酶分解得到的產物青霉噻唑酸具有還原性，與亞銅試劑發生絡合反應生成紫紅色絡合物，在一定范圍內絡合物的顏色深淺與β-內酰胺酶的量呈線性關系。將醋酸纖維素膜（CA）作為顯色層放在亞銅試劑（2.5%2,2'-聯喹啉乙醇溶液與0.2 mol/L CuSO4溶液均勻混合）中浸泡10 min，進行顯色反應，45℃下真空干燥30 min，制得β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙；配制β-內酰胺酶標準品溶液0～250 U/mL（0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL），在顯色層進行顯色反應后，利用分光測色儀測定不同梯度下的顏色，得到L*值，a*值和b*值，并應用色彩模塊軟件進行模擬，按照β-內酰胺酶標準液的濃度梯度進行排列、粘貼，制成β-內酰胺酶標準比色卡。通過試驗得出β-內酰胺酶在牛奶樣品中最低檢出限為6 U/mL，相對誤差范圍7.51%～15.38%。β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙具有快速、操作簡單、經濟實用、易于普及和現場測定的優點。

β-內酰胺酶；快速檢測試紙；牛奶

革蘭氏陽性菌分泌產生的β-內酰胺酶（βlactamase），具有可選擇性酶解牛奶中殘留的β-內酰胺類抗生素的能力，通過破壞7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）和6-氨基青霉烷酸（6-APA） 等結構，進而破壞抗生素并且使酶解后的物質進入奶制品中，酶聯免疫法、微生物法等常規檢測方法在檢測中失效，從而常規方法無法準確檢測出是否含有抗生素，掩蓋抗生素超標的事實[1-2]。在堿性條件下，β-內酰胺酶與青霉素發生反應，親核性基團向青霉素內的β-內酰胺環進攻，破壞7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）和6-氨基青霉烷酸（6-APA）等結構，β-內酰胺環開環后脫羧重排形成中間體青霉噻唑 酸[3-4]。實際生產中，有些微生物雖然可以產生β-內酰胺酶，但由于牛奶組分、采奶方式、滅菌方法、包裝方法和儲存條件的影響，使產β-內酰胺酶的微生物無法生存，只有在人為條件下添加β-內酰胺酶才能夠檢測到微生物分泌的β-內酰胺酶[5]。因中間產物青霉噻唑酸具備將二價銅離子還原為一價銅離子的還原性。在Baker WL的報告中[6]，在2,9-二甲基-1,10-菲啰啉、2,2'-聯喹啉與一價銅的反應中，前者的反應環境要求pH值為3.2～6.5，生成黃色絡合物，于波長460 nm處有最大吸收峰；后者的反應環境要求pH值為3.5～7.0，生成紫紅色絡合物，于波長520 nm處有最大吸收峰。牛奶的顏色為乳白色，pH值為6.8，在2,2'-聯喹啉反應環境之間，且肉眼容易觀察到牛奶中出現紫紅色的顏色變化，故在2,9-二甲基-1,10-菲啰啉試劑與2,2'-聯喹啉試劑的選擇中，選擇2,2'-聯喹啉作為顯色劑，故以雙光束紫外-可見分光光度法為基礎，建立一種快速、操作簡單、經濟實用、易于普及和現場測定的乳制品中β-內酰胺酶半定量快速檢測方法。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

標準品β-內酰胺酶、標準品青霉素鉀，購自中國藥品生物制品檢定所；2,2'-聯喹啉，購自上海晶純試劑有限公司；三氯乙酸（TCA）、硫酸銅、冰醋酸，均為分析純，購自洛陽市化學試劑廠。

2.2 試驗儀器

UV-6100型雙光束紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限責任公司產品；DZF-6090型真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；SMY-2000型全自動測色色差儀，北京盛名揚科技開發有限責任公司產品；AUY220型電子天平，日本島津公司產品。

2.3 試驗方法

2.3.1 檢測試紙的制備

亞銅試劑的配制：0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的2,2'-聯喹啉乙醇溶液（B）；0.05，0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L CuSO4的硫酸銅溶液（C），將B液和C液進行梯度混合均勻后即得顯色液。將顯色層醋酸纖維素膜浸入上述顯色液中，顯色反應10 min后，置于玻璃板上真空干燥箱中45℃下干燥30 min，制成顯色層，裁剪成10 cm×1.0 cm，將過濾層、顯色層和吸收材料層粘貼在基板上，得到β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙。

2.3.2 β-內酰胺酶標準比色卡的制備

（1）配制9份濃度為5 000 U/mL的青霉素底物溶液，分別加入濃度為0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL β-內酰胺酶標準溶液，混合均勻后于37℃下水浴60 min。

（2）取出后加入5 mL添加15%TCA，以轉速4 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，然后將上述制備β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙浸入上清液5～10 min后取出，進行顯色反應。

（3）使用測色儀測定顏色反應的L*值，a*值和b*值，并利用計算機中的色彩模塊軟件對顏色反應的數值進行模擬，制作標準比色塊。按照β-內酰胺酶標準液的濃度梯度進行排列、粘貼，制成β-內酰胺酶標準比色卡。

2.3.3 實際最低檢出限和精確度

（1）試紙實際最低檢出限。用市售牛奶配制含有0，4，6，12，25，50，100，150，200 U/mL β-內酰胺酶，青霉素鉀底物濃度皆為5 000 U/mL的 9個樣品，于37℃下水浴1 h，按1∶1比例添加15%的TCA溶液，倒入離心管，混合均勻，放入離心機，以轉速4 000 r/min離心10 min，取上清液，制備出不同濃度的待測樣品。取β-內酰胺酶測定試紙，浸入待測樣品溶液10 min，取出后與標準比色卡對照，即得到β-內酰胺酶的最低檢測限[7]。

（2）試紙檢測的準確度。配置β-內酰胺酶濃度梯度溶液，0，4，6，12，25，50，100，150，200 U/mL，在試紙顯色層上做顯色反應，觀察顯色結果，與分光光度法進行對比，計算相對誤差表示準確度[8]。

3 結果與討論

3.1 亞銅試劑的濃度對試紙顯色的影響

樣品添加量0.2 mL，底物濃度50 000 U/mL，反應時間10 min，隨著亞銅試劑的濃度逐步升高，試紙顯色紫紅色逐漸變淺，其中2.5%2,2'-聯喹啉乙醇溶液和0.2 mol/L CuSO4的硫酸銅溶混合組成的亞銅試劑，試紙顯色為深紫紅色。

亞銅試劑的濃度對試紙顯色的影響見圖1。

圖1 亞銅試劑的濃度對試紙顯色的影響

3.2 標準比色卡的制備

取2.3.2中9個發生顏色反應的試紙，使用分光測色儀測定試紙L*值，a*值和b*值等顏色反應數值，利用計算機中顏色模塊軟件對顏色反應的數值進行模擬后制作標準比色塊。制作β-內酰胺酶的標準比色卡，可以看出顏色梯度的變化，隨著β-內酰胺酶濃度增加紅色漸漸加深。

β-內酰胺酶標準比色卡見圖2，色卡的L*值、a*值、b*值見表1。

3.3 最低檢出限

將β-內酰胺酶測定試紙浸在待測牛奶樣品中5 min后取出與標準比色卡比照。由表2可知，當牛奶中β-內酰胺酶的濃度達到6 U/mL時，5 min內試紙就出現很淺的淡粉色，而低于6 U/mL時沒有出現顯色反應，即得出試紙對牛奶中β-內酰胺酶的最低檢出限為6 U/mL。

圖2 β-內酰胺酶標準比色卡

表2 試紙檢出限的確定

表3 β-內酰胺酶試紙準確度

試紙檢出限的確定見表2。 9個色塊，分別對應β-內酰胺酶的9個濃度：0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL，顏色從淺粉色漸變至深紫色，色階梯度明顯；檢測試紙檢測最低檢出限為6 U/mL，相對誤差范圍為7.51%～15.38%。

3.4 試紙檢測方法的精確度

β-內酰胺酶試紙準確度見表3。

由表3可知試紙檢測與的準確度范圍為7.51%～15.38%。

4 結論

檢測試紙的制備條件為醋酸纖維素膜（CA）為載體制備顯色層，在亞銅試劑（0.2 mol/L CuSO4溶液和2.5%2,2'-聯喹啉乙醇溶液）中浸泡10 min進行顯色反應，于45℃下真空干燥30 min，制備出β-內酰胺酶半定量快速檢測試紙；標準比色卡含有

[1]崔生輝，李景云，馬越，等.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測 [J].中國食品衛生雜志，2007，19（2）：113-116.

[2]鄭穎，王震，范泉水，等.TEM-116型超廣譜β-內酰胺酶對牛奶中抗生素的清除 [J].中國抗生素雜志，2008，33（2）：122-124.

[3]趙靜玫，都絳瑛.青霉素裂解液的高效液相色譜分析[J].色譜，2001，19（1）：88-89.

[4]鄭巖，王英武，周慧，等.電噴霧四級桿飛行時間質譜法在分析青霉素類藥物負離子裂解規律中的應用 [J].分析化學研究簡報，2004，32（2）：183-184.

[5]黃曉蓉，于竸，鄭晶，等.牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留的快速檢測方法 [J].中國乳品工業，2004，32（2）：44-47.

[6]Baker W L，唐建國，譯.在中性pH值及室溫下用二唆琳甲酸鹽分析β-內酞胺酶 [J].國外醫藥抗生素，1990，11（3）：181-182.

[7]孫秀蘭，楊婷婷，張銀志.糧食中百草枯殘留的金標免疫層析檢測方法研究 [J].分析測試學報，2010，29（5）：507-510.◇

Study on the Semi-quantitative Rapid Test Strip of β-lactamase in Milk

SHI Chunyu
（Zhengzhou No.11 High School，Zhengzhou，He'nan 450002，China）

Penicilloic acid，the decomposer of penicillin G potassium by β-lactamase has the reducibility.The 2,2'-biquinolyl can coupling with Cu+to display purple，which the color depth and the amount of β-lactamase are in linearly within a certain range.The cellulose acetate membrane is used as colourably layer and immersed cuprous reagent of 2.5%2,2'-biquinolyl，0.2 mol/L of CuSO4for 10 min color reaction.The semi-quantitative rapid test for β-lactamase is prepared after vacuum drying for 30 min.The β-lactamase standard solution for gradient concentration 0～250 U/mL（0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL） for colour reaction is prepared，using spectro-colorimeter to determine the color reaction L*，a*，b*value data，and application the color module software on its for simulation to prepare the standard color card.The detection limit of kit is 6 U/mL and relative error is 7.51%～15.38%.The β-lactamase kit method is rapid，simple，economical and practical，easy to spread and site.

β-lactamase；rapid test strip；milk

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.003

1671-9646（2016）12a-0011-03

2016-11-05

施春煜（1998— ），男，在讀學生，研究方向為生物化學及生物技術。