青蒿琥酯對顎部小涎腺腺樣囊性癌細胞系增殖侵襲能力及SP1蛋白表達的影響

陳宇麟，陳　虎，李佳荃，農曉琳

(廣西醫科大學1.口腔醫學院口腔頜面外科；2.醫學科學試驗中心，廣西 南寧　530021)

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青蒿琥酯對顎部小涎腺腺樣囊性癌細胞系增殖侵襲能力及SP1蛋白表達的影響

陳宇麟1，陳虎1，李佳荃2，農曉琳1

(廣西醫科大學1.口腔醫學院口腔頜面外科；2.醫學科學試驗中心，廣西 南寧530021)

摘要：目的探索青蒿琥酯(ART)對人顎部小涎腺腺樣囊性癌(NACC)細胞增殖、侵襲能力的影響。方法用MTT法檢測經37.5、150、600 μmol·L-1ART干預24、48 h后，NACC細胞體外增殖水平的變化；Transwell法檢測37.5、150、600 μmol·L-1ART干預48 h后，NACC細胞體外侵襲能力的變化；Western Blot法檢測ART干預48 h后，NACC細胞中轉錄因子SP1蛋白表達水平的變化;各實驗方法均設立空白對照組及5 μmol·L-1順鉑(DDP)陽性對照組。結果與對照組比較，ART作用于NACC細胞24 h時即表現出對其增殖能力的抑制作用(F=12.071，P<0.001)，作用時間延長至48 h時，抑制作用更加明顯(F=169.098，P<0.001)；Transwell實驗中，與對照組相比，37.5、150、600 μmol·L-1ART組穿膜細胞數量明顯減少(F=139.939，P<0.001)；Western Blot實驗結果顯示：與空白對照組相比，37.5、150、600 μmol·L-1ART及5 μmol·L-1DDP陽性對照組中SP1蛋白表達水平均出現不同程度的下降(F=200.998，P<0.001)。結論青蒿琥酯可以有效抑制NACC細胞體外增殖及侵襲能力，并下調轉錄因子SP1表達，二者間可能存在聯系。

關鍵詞：青蒿琥酯；腺樣囊性癌；增殖；侵襲；轉錄因子；SP1

Influence of Artesunate on proliferation, invasion ability and the

expression levels of SP1 protein of novel human palatal salivary

gland cell line of adenoid cystic carcinoma

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是一種好發于涎腺的惡性腫瘤，具有生長相對緩慢，有嗜神經侵襲、易沿血管侵襲擴散的特性，在癌變的早期即可發生轉移。單純通過手術治療難以徹底切除癌變組織，治療后很容易復發，且伴有極高的遠處轉移率，長期預后效果不佳。化療是臨床治療ACC的重要組成部分，特別是針對發生轉移之后，化療更是成為了主要的治療手段。青蒿素是從黃花蒿中分離出來的化合物[1]，是一種高效、低毒的抗瘧藥[2]，近年來的研究表明[3-4]，青蒿素及其衍生物不僅在治療瘧疾方面卓有成效，在抑制腫瘤的方面也表現出了值得關注的潛力。本課題組前期使用青蒿琥酯(ART)對人源顎部小涎腺腺樣囊性癌NACC細胞系進行了體外干預，發現青蒿琥酯在體外可以促使NACC細胞凋亡、抑制其遷移能力[5-6]。為進一步探明青蒿琥酯對腺樣囊性癌的作用，本實驗研究擬從該藥抑制腫瘤細胞增殖、侵襲能力。和對轉錄因子SP1的影響方面入手，做進一步探索。

1材料

1.1細胞株腺樣囊腺癌細胞株NACC由課題組前期原代培養并穩定傳代獲得[7]。

1.2試劑與藥物RMPI-1640細胞培養基(杭州四季清公司)；四甲基氮唑鹽MTT(美國SIGMA)；二甲基亞砜DMSO(北京Solarbio)；SP1一抗濃縮型，熒光二抗(英國Abcam)；Matrigel基質膠( 美國BD 公司)；細胞培養瓶(美國Corning,底面積為25 cm2);96孔板，Transwell小室(美國Costar，膜孔徑為8 μm)；順鉑注射液(江蘇豪森藥業股份有限公司)；注射用青蒿琥酯(廣西桂林南藥股份有限公司)。

1.3主要實驗儀器CO2培養箱(日本SANYO)；酶標儀(美國BIO)；CKX41 型倒置相差顯微鏡(Olympus) NanoDrop200-型Thermo紫外分光光度計 (Thermo)；臺式高速低溫離心機(Eppendorf公司)；電泳儀(美國BIO-RAD)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(美國LI-COR公司)。

2方法

2.1細胞的培養腺樣囊腺癌細胞株NACC生長于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的RMPI-1640細胞培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。待細胞生長接近80%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2四甲基氮唑鹽(MTT)法檢測青蒿琥酯對NACC細胞增殖的抑制作用收集對數生長期的各組細胞, 以0.25%胰酶消化, 計數, 接種于96 孔培養板內, 使每孔細胞密度為5 000個,置于37℃、5%CO2培養箱中24 h，換含有37.5、150、600 μmol·L-1ART和5 μmol·L-1DDP的無血清培養基培養20 、44 h，以不含藥物的無血清培養基為空白對照。每孔加20 μL MTT，繼續孵育4 h，棄培養液。接著每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，每個濃度設置3個復孔，用酶標儀測定每孔吸光度值，實驗重復3次。

2.3Transwell細胞侵襲實驗檢測青蒿琥酯對NACC細胞侵襲能力的抑制作用在Boyden小室下室加入含10%FBS的RPMI-1640培養基作為趨化因子, 上下室之間由聚碳酸酯微孔濾膜隔開(直徑13 mm 、孔徑8 μm), 膜上均勻鋪每孔60 μL/的人工基底膜膠(Matrigel , BD 公司),37℃溫箱聚合30 min。將NACC細胞按照1×105個每孔，接種于六孔板中，待NACC細胞處于對數生長期時用含37.5、150、600 μmol·L-1ART和5 μmol·L-1DDP的完全培養基干預48 h，以不含藥物的完全培養基作為空白對照，干預完成后用0.25%的胰酶消化收集細胞，計數并重懸，每組取細胞懸液400 μL(2 ×104個細胞)加入上室,于37℃, 5%CO2條件下培養24 h。吸棄上室液體，擦去小室膜內表面未侵襲的細胞及Matrigel膠,每個小室加入200 μL PBS液漂洗，棄去PBS后，用4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色。每組設3個平行樣本，隨機計數5個400倍顯微視野下的穿膜細胞數, 計算平均值, 進行統計學分析，實驗重復3次。

2.4蛋白印跡法檢測青蒿琥酯對SP1蛋白表達的影響分別收集用上述藥物干預后的細胞，用蛋白裂解液處理之后離心取上清，加入蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸15 min，分別取各組蛋白400 μg于10%SDS-PAGE電泳、電轉移到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h，覆上SP1兔單抗(1∶1 000)過夜，TBST洗滌5次，每次5 min。加入熒光標記的山羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min(注意避光操作)，掃描PVDF膜進行圖像分析，實驗重復3次。

3結果

3.1青蒿琥酯對NACC細胞增殖的抑制作用結果顯示：青蒿琥酯作用24 h，對NACC細胞具有一定的抑制作用，各實驗組及陽性對照組與空白組比較，結果均有統計學意義，實驗組及陽性對照組間比較未見明顯統計學差異(表1)。青蒿琥酯作用48 h，各實驗組及陽性對照組與空白對照組比較，各實驗組組間比較，除600 μmol·L-1ART組外其余各實驗組同陽性對照組比較，結果均有統計學意義，F=169.098，P<0.001(表1)。

±s,n=3)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與陽性對照組比較，ΔΔΔP<0.001。

3.2青蒿琥酯對NACC細胞侵襲能力的抑制作用

400倍鏡下每個副孔隨機選取5個視野，計數穿膜細胞個數并求取平均值，空白對照組(103±15.4)個、37.5 μmol·L-1ART組(52±6.8)個、150 μmol·L-1ART組(22±2.9)個、600 μmol·L-1ART組(7.6±2.2)個、陽性對照組(5±1.6)個，結果顯示，各實驗組及陽性對照組穿膜細胞個數與空白對照組比較差異明顯，具有統計學意義，37.5 μmol·L-1ART組穿膜細胞個數與600 μmol·L-1ART組及陽性對照組比較，差異有統計學意義，150 μmol·L-1ART組、600 μmol·L-1ART組及陽性對照組間比較，差異無統計學意義，F=139.939，P<0.001(圖1A、1B)?？瞻讓φ战M37.5 μmol·L-1ART150 μmol·L-1ART

600 μmol·L-1ART陽性對照組

圖1A不同濃度ART干預NACC細胞 圖1B不同濃度ART干預48 h對NACC細胞

48 h后(×400) 穿膜細胞數侵襲能力的抑制作用

注：**P<0.01，***P<0.001。

3.3青蒿琥酯對NACC細胞SP1蛋白表達的影響采用Western Blot法，進行蛋白含量檢測。相對灰度值空白對照組(2.14±0.06)、37.5 μmol·L-1ART組(1.89±0.05)、150 μmol·L-1ART組(1.66±0.03)、600 μmol·L-1ART組(1.42±0.04)、陽性對照組(0.79±0.11)，結果顯示:各實驗組及陽性對照組于空白對照組相比，差異有統計學意義，各實驗組及陽性對照組組間比較均有差異，具有統計學意義，F=200.998，P<0.001(圖2A、2B)。

圖2A　不同濃度ART干預NACC細胞

圖2B　不同濃度ART干預NACC細胞48 h

注：***P<0.001。

4討論

腫瘤的發生發展與體內各種因子間相互作用有著密切的關系，在眾多因子之中，轉錄因子在細胞核內起著重要的作用，它們通過調控細胞周期相關分子、促癌及抑癌基因，影響著腫瘤的發生發展。SP1蛋白屬于Sp/KLF轉錄因子家族，具有調控眾多基因表達的能力，正常情況下，SP1蛋白在體內各種細胞中均有較穩定的表達，并對多種管家基因具有調控的功能[8-9]，會隨著細胞的老化而逐漸減少表達。而在乳腺癌[10]、甲狀腺癌等腫瘤組織中，SP1蛋白的表達水平顯著高于正常組織的表達水平。有研究表明SP1蛋白的表達水平也影響著血管形成[11]，進而影響到腫瘤的生長和轉移。而下調SP1的表達能夠有效抑制腫瘤細胞的生長。因此SP1被公認為一個重要的促癌蛋白。

前期研究[5]中通過細胞劃痕實驗發現，青蒿琥酯通過抑制劃痕愈合的方式表明其對腺樣囊性癌NACC細胞運動能力的抑制作用，同時較低濃度的青蒿琥酯可以將NACC細胞阻滯在G1期，而當濃度達到50 mg·L-1時則可以將NACC細胞阻滯與G2期。本研究中，MTT實驗結果表明使用青蒿琥酯干預NACC細胞，在作用24 h后，即表現出對NACC細胞增殖的有效抑制，伴隨作用時間的延長，抑制NACC細胞增殖的效果也愈發明顯，且呈現濃度依賴性，與前期研究結果相符，600 μmol·L-1的青蒿琥酯與5 μmol·L-1的順鉑作用效果比較接近；侵襲實驗的結果表明，青蒿琥酯能有效抑制NACC細胞降解細胞周圍基質并向周圍組織浸潤的能力，起到抑制腫瘤細胞侵襲的作用。

通過分析實驗結果，我們發現青蒿琥酯作用于NACC細胞系后，成功的抑制了NACC細胞在體外的增殖和侵襲的能力，且具有濃度依賴性，這一結果同Western Blot檢測SP1蛋白表達水平的結果保持較高的一致性，青蒿琥酯濃度越高，SP1蛋白表達水平下降的越明顯，說明青蒿琥酯可以有效降低促癌蛋白SP1的表達；結合Schulze[12]對前列腺癌AKR1C3S基因啟動子同SP1間關系的研究，以及Sankpal等[13]通過靶向抑制SP1的表達治療前列腺癌的研究等眾多研究結果，我們認為青蒿琥酯抑制腺樣囊性癌增殖與侵襲的作用與NACC細胞SP1蛋白表達水平下降可能存在重要的聯系。本實驗為進一步探討青蒿琥酯抑制腫瘤增殖侵襲作用的機制，將青蒿琥酯應用于腺樣囊性癌治療提供了體外實驗的支持。

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CHEN Yu-lin1, CHEN Hu1, LI Jia-quan2, et al

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery，CollegeofStomatology;

2.MedicalScienceResearchCenter，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Abstract:Objective To explore the effect of artesunate (ART) on proliferation and invasion of novel human palatal salivary gland cell line of adenoid cystic carcinoma (NACC). MethodsThe changes of in vitro proliferation of NACC cells after being intervened for 24 and 48 hours by 37.5,150,600 μmol·L-1ART were analyzed by using MTT assay; the anti-invasion effect of ART at 37.5,150,600 μmol·L-1were tested by Transwell assay; the expression level of SP1 protein in each group was detected by Western Blot method. All experiments were performed with a control group and a positive control group with 5 μmol·L-1DDP.ResultsCompared with the control group, the effect of ART on the proliferation of NACC cells was significantly increased after treated for 24 hours (F=12.071,P<0.001), and the inhibition was more obvious than that by extending the intervention time to 48 hours (F=169.098,P<0.001). In Transwell assay, the number of cells passing through the membrane in experimental group (37.5,150,600 μmol·L-1ART groups) was significantly decreased, compared with the control group (F=139.939，P<0.001).Western Blot results showed that the expression levels of SP1 protein in 37.5,150,600 μmol·L-1ART and 5 μmol·L-1DDP positive control group were decreased (F=200.998,P<0.001), compared with the blank control group. ConclusionsArtesunate could effectively inhibit the NACC cell proliferation and invasive ability, and down-regulate the expression of transcription factor SP1.

Key words:artesunate;adenoid cysticcarcinoma;proliferation;invasion;transcription factor;SP1

收稿日期：(2015-10-12，修回日期：2015-11-23)

通信作者：農曉琳，女，教授，碩士生導師，研究方向：口腔頜面外科，E-mail：lab．nong@gmail.com

基金項目：國家自然科學基金項目(No 81360404)；廣西省自然科學基金面上項目(No 2013GXNSFAA019231)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.006