實時熒光PCR檢測食品中牛及豬源性成分

左澤彥， 孫端方

(貴州省產品質量監督檢驗院， 國家酒類及加工食品質量監督檢驗中心， 貴州 貴陽 550016)

實時熒光PCR檢測食品中牛及豬源性成分

左澤彥， 孫端方*

(貴州省產品質量監督檢驗院， 國家酒類及加工食品質量監督檢驗中心， 貴州 貴陽 550016)

為快速檢測出食用肉類中摻假物質，確保消費者切身利益，維持正常市場秩序，提升貴州省產品質量監督檢驗的檢測能力，采用實時熒光定量PCR對豬源性成分和牛源性成分進行檢測。結果表明：熒光PCR可以用來檢測豬、牛等動物源性成分，且檢測靈敏度為1%；熒光PCR檢測動物源性成分提高了檢測效率及靈敏度，降低了假陽性機率。

實時熒光定量PCR； 動物源性成分； 牛； 豬； 檢測

近年來，食用肉類摻假事件逐漸成為當前食品安全熱點問題，繼2013年歐洲馬肉風波之后，肉類摻假已引起全球的重點關注[1]。同年我國濟南沃爾瑪發生狐貍肉冒充牛肉、驢肉事件；北京、上海等一線城市相繼披露了制售摻假羊肉事件；2015年7月，在埃及法雨地區也發生了肉類摻假事件[2]。究其原因，實為不法商販以低價肉類冒充或摻假高價肉類擷取違法利益。但當前肉類摻假工藝復雜，尤其在肉類加工品中為甚，僅憑感官和傳統方法無法鑒別。既損害消費權益，也危害市場[3]。因此，各檢測機構有必要建立高效的食品及相關產品中動物源性成分的鑒定方法，從而對市售動物源性食品進行快速、準確、全面的監測。

實時熒光PCR技術(real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR)在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個反應進程的PCR技術，并可通過標準曲線對未知模板進行定性及定量分析[4]；具有特異性強、靈敏度高、準確性好、污染程度低和分析速度快等優勢[1]。2013年，范麗麗[5]等用RT-PCR檢測食品中豬源性成分，得出各肉類中豬肉成分檢出限為1%。2015年，高曉麗等用RT-PCR檢測貓源性成分[6]，檢測靈敏度為100 fg。當前，RT-PCR被認為是肉類真實性鑒定中最有潛力的分子檢測工具。

面對國內肉類摻假事件日益嚴峻和輿論不斷重點關注的現狀，為更好地確保消費者的切身利益，貴州省產品質量監督檢驗院參與CANS組織的豬牛源性成分測定，以提升貴州省產品質量監督檢驗的綜合檢測能力，為今后介入動物源性食品真實性成分鑒定、市售肉類食品摻假現狀調查和積累相關檢測科研數據等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：試驗中所用的豬組織成分、牛組織成分由遼寧出入境提供(陰性、陽性為確定)。

試劑：基因組提取試劑盒(TaKaRa，AK501-1)、牛源性試劑盒(TaKaRa，A1501-1)，豬源性試劑盒(TaKaRa，A1401-1)等均購于TaKaRa(大連)公司，瓊脂糖(Agarose)、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑均為國產。

儀器：移液器量程覆蓋0.1 ～104μL共5支(Eppendorf)、小型離心機(Labongene)、紫外分光光度計(Thermo)、RT-PCR儀(ABI Step One Plus)、電泳儀(Hofer)、凝膠成像儀(Bio-Rad)。

1.2 動物基因組DNA 提取

稱取西林瓶中動物組織粉末25～100 mg于1.5 mL的離心管中，按照基因組提取試劑盒說明書提取動物基因組DNA，以0.7%瓊脂糖在1×TAE buffer中5 V/cm電泳0.5 h后，利用凝膠成像系統檢測DNA純度及完整度，并用紫外分光光度計檢測其質量和濃度。

1.3 實時熒光PCR 反應體系與反應循環參數

1.3.1 反應體系 根據牛、豬源性試劑盒，熒光PCR反應體系為2×Premix for Bovine/Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Bovine/Porcine 1 μL，Probe Mix for Bovine/Porcine 1 μL，樣品DNA(陰性對照用雙蒸水替代；空白對照用雙蒸水替代；陽性樣品用試劑盒自帶的control DNA for Bovine/Porcine替代樣品DNA。) 1 μL，加三蒸水補至25 μL。

1.3.2 反應程序 根據牛、豬源性試劑盒，熒光集團選擇FAM，猝滅集團選擇無，熒光PCR反應程序為第一步：95℃ 10 s，1 Cycles；第二步： 預變性95℃ 5 s，60 ℃退火 30 s，收集熒光信號，40 Cycles。

1.4 檢測結果的判斷

PCR反應結束后，將基線調整為3～15個循環的熒光信號(閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點)，根據Ct值(循環閾值)及有無明顯擴增曲線判定結果。陰性對照：無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無S型擴增曲線；陽性對照：Ct≤35，呈S型擴增曲線。內參圖譜(HEX)用來檢驗熒光PCR儀及試劑的性能。

2 結果分析

2.1 牛、豬的基因組DNA

由圖1可知，提取的牛、豬基因組DNA電泳條帶遷移率低，條帶明亮整齊，溴酚藍前沒有明亮的熒光區，點樣孔內沒有亮點，表明提取的牛、豬基因組DNA純度較高，沒有蛋白質和RNA的污染或污染藥材水分含量在10.51%～11.23%，平均10.745%；總灰分含量為5.56%～7.95%，平均6.477%；酸不溶性灰分含量0.61%～0.79%，平均0.691%；醇溶性浸出物含量為16.12%～18.38%，平均值為17.557%。不同產地的相應含量存在一定的差異。

注：M，marker；1，豬基因組；2，牛基因組。

Note：M，marker；1，genomic DNA of porcine；2，genomic DNA of bovine.

圖1 牛、豬基因組 DNA電泳結果

Fig.1 DNA electrophoresis pattern of bovine and porcine genome

2.2 牛及豬源性成分

由圖2可知，1) 牛源性成分的陰性對照、空白對照均有HEX擴增曲線，無Ct值，無FAM；陽性對照有FAM和HEX擴增曲線，Ct <28，樣品有FAM和HEX擴增曲線，Ct≤35，根據試劑盒說明判定牛源性成分為陽性。

2) 豬源性成的陰性對照、空白對照均有HEX擴增曲線，無Ct值，無FAM；陽性對照有FAM和HEX擴增曲線，Ct <28，樣品有FAM和HEX擴增曲線，Ct≤35，根據試劑盒說明判定豬源性成分為陽性。因驗證涉及貴州省產品質量監督檢驗院的資質項目，因此空白對照一組中選擇雙蒸水代替其他動物成分，充分說明熒光PCR可以用于檢測豬、牛藥材水分含量在10.51%～11.23%，平均10.745%；總灰分含量為5.56%～7.95%，平均6.477%；酸不溶性灰分含量0.61%～0.79%，平均0.691%；醇溶性浸出物含量為16.12%～18.38%，平均值為17.557%。不同產地的相應含量存在一定的差異。

圖 2 牛、豬源性的熒光圖譜及內參圖譜

3 結論

試驗表明，實時熒光PCR測定豬及牛源性成分的結果為豬源性成分為陽性，牛源性成分為陽性，與遼寧出入境反饋結果一致，證明貴州省產品質量監督檢驗院具備檢測動物源性成分的能力，檢測靈敏度為1%。對于提升貴州省產品質量監督檢驗的綜合檢測能力、滿足國家酒類及食品檢驗中心的建設需求具有重要意義，為今后動物源性食品真實性成分鑒定、市售肉類食品摻假現狀調查、積累相關檢測科研數據等奠定基礎。

[1] 高曉麗,楊昕霆,王 丹,等.實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中貓源性成分[J].食品科學,2014,35(24):235-238.

[2] 李 楠,王佳慧,沈 青,等.北京地區牛、羊肉片中鴨、雞、豬源性成分調查[J].中國食品衛生雜志,2014,26(3):227-232.

[3] 胡智愷,宋麗萍,姜 潔,等.實時定量PCR法對牛肉中雞源性成份的量化檢測[J].食品安全質量檢測學報,2015,6(2):550-554.

[4] 李家鵬,喬曉玲,田寒友,等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術研究進展[J].食品科學,2011,32(9):340-347.

[5] 范麗麗,李 培,傅春玲,等.實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中豬源性成分[J].食品科學,2013,34(8):224-227.

[6] 高曉麗,楊昕霆,薛晨玉,等.實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中狗源性成分[J].食品工業科技,2015,36(2):61-64.

(責任編輯： 孫小嵐)

Bovine Derived Materials and Porcine Derived Materials Detecting with Real-time Fluorescence PCR

ZUO Zeyan， SUN Duanfang*

(QualitySupervisionandInspectionCenterofNationalLiquorandProcessedFoods,GuizhouProvinceProductQualitySupervisionandInspectionInstitute,Guiyang,Guizhou550016,China)

In order to rapidly detect adulterants in meat, ensure consumers’ vital interests, maintain a normal market order and enhance the detectability of Guizhou Province Product Quality Supervision and Inspection Institute, the bovine derived materials and porcine derives materials were detected by using real-time quantitative PCR. Results: Real-time quantitative PCR was suitable for detecting bovine derived materials and porcine derives materials with detection sensitivity of 1%; Detection efficiency and sensitivity were enhanced and false positive rate was decreased.

real-time quantitative PCR; animal-derived materials; bovine; pig; detection

2015-09-28； 2016-3-25修回

左澤彥(1985-)，男，工程師，碩士，從事食品檢測、動物源性和轉基因檢測研究。E-mail：zuozeyan2008@163.com

*通訊作者:孫端方(1987-)，男，高級工程師，博士，從事食品檢測研究。E-mail：340109925@qq.com

1001-3601(2016)04-0177-0130-03

S851.34+7.1/.7； TS207.3

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